Bu araştırma için finansman Rosebay Tıp Vakfı ve Yale Tıp Fakültesi Dekan Araştırma Fonu (JH) geldi. Biz davranışsal deneyler ile yardım için Dr Claire Koenig teşekkür ederim. Genetiği değiştirilmiş fare hatları Ozgene (Perth, Avustralya) oluşturulmuştur.

Etik bildirimi: hayvanlarla ilgili çalışmalar Yale Üniversitesi&#39;nde Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) için Kılavuzu Sağlık önerileri National Institutes uygun olarak yapılmıştır. Genetiği Değiştirilmiş 1. Farelerin Davranış Testi Not: Tüm fareler işleme için alışkanlık farklılıkları sınırlamak için aynı test rejimine tabi tutulmalıdır. Testler günün aynı saatinde her zaman yapılmalıdır. <ol><li> Yenidoğan Hind Ekstremite Testi Not: arka bacak testi proksimal arka bacak kas kuvveti, halsizlik ve yorgunluk değerlendirmek için P10 için doğum sonrası gün (P) 4 günlük yapılır. <ol><li> test alanına ulaşım fareler testten önce 30 dakika dinlendirilir ve. </li><li> t altına iki (P4-P8) ya da bir (P9-P10) pamuk topları iterek,% 70 etanol ile 50 ml konik bir tüp temizleyerek test cihazı hazırlanmasıUbe ve dik bir pozisyonda sabitlenir. </li><li> Kafes ve kayıt ağırlığı bir yavru çıkarın. test değil her ısı pad üzerinde tepsiyi tutarak yavru tutun. </li><li> Hafifçe pamuk topları doğru aşağı bakacak öyle ki, konik tüp jant üzerinde yenidoğanın arka bacaklarda askıya. Bir kronometre kullanarak düşmek yapılan çekme girişimleri ve ölçü gecikme sayısını. </li><li> işaretleyici ile yavru etiket bir kez daha tekrarlayın. Daha sonra, ayak kırpma ile P6 yavrular tespit. değiştirmeden önce ev kafesinden yatak ile hafifçe yavrular ovun. </li><li> % 70 etanol ile konik tüp silin. </li><li> Bütün çöp test edilmiştir kadar bir sonraki yavru üzerinde test tekrarlayın. </li><li> pamuk ve konik tüp atınız. % 70 etanol ile temizleyin tüm ekipman. </li></ol></li><li> Sütten kesilmiş Gözlem Testi Not: sütten kesilmiş gözlem testi hareketi ve genel aktivite seviyelerini puanı P21 için P19 günlük olarak uygulanır. <ol><li> test alanı a ulaşım farelernd testten önce 30 dakika boyunca dinlenmeye bırakın. </li><li> % 70 etanol ile temizleyerek baz 2 inçlik kareler 6x6 ızgara ile işaretlenmiş pleksiglas test kutu hazırlayın. Bütün kutu görüş alanında olacak şekilde yan video ekipmanı ayarlayın. kurmak ve yenilik tanıtma önlemek için her gün aynı surroundings tutun. </li><li> Temiz bir tutma fincan kafes ve yerden bir sütten kesilmiş çıkarın. Tutanak ağırlık. </li><li> Fare kimlik numarası, yaş ve test tarihi ile test kimlik kartı filme video kaydı başlar. merkez meydanına kupayı tutarak fareyi aktarın. üç dakika zamanı, test sırasında fare iki ön pençeleri ile geçilen çizgilerin sayısını sayarak. </li><li> Temiz bir kafes ve bitiş video kayıt fare dönün. </li><li> % 70 etanol ile test aparatı temizleyin. </li><li> Tüm çöp test edilene kadar, sonra ev kafesine tüm yavrular iade tekrarlayın. </li><li> % 70 etanol ile temizleyin tüm test ekipmanları. </li><li&gt; Video kullanarak, bir fare desteği açık iki ön pençeleri ile nerede durduğunu, görsel gözlem sonrası Sayım işlemleri ve her iki ön pençeleri temizlik yapan olayları, damat ile olayları yetiştirme sayısını quantitate. </li></ol></li><li> Hasır Kavrama Dayanım Testi Not: kavrama kuvveti testi P22 ve P26 arasında günaşırı yapılır, nöromüsküler gücünü değerlendirmek için. <ol><li> Test alanına taşınması fare ve test etmeden önce 30 dakika süre ile kafes evlerinde dinlenmeye bırakın. </li><li> % 70 etanol ile bir pleksiglas kutu ve örgü ızgara temizleme aparatı hazırlayın. Kutunun alt bubble wrap yerleştirin ve kağıt ile kaplayın. </li><li> Bireysel tutma bardak yerleştirerek üç gruba ayrı fareler. </li><li> tel örgü merkezi üzerine ilk fare koyun ve yavaş yavaş Pleksiglas kutusunun alt yumuşak yüzeyi üzerinde 10-20 cm ters çevirin. Bir kronometre kullanarak düşmeye gecikme ölçün. Fare yapmazsa 60 sn geçtikten sonra test sonlandırdüşmek. </li><li> % 70 etanol ile örgü ve bubble wrap üzerinde kağıt yerine mendil, tutma fincan fare dönün. İlk dönmeden önce grupta kalan iki fareler üzerinde test yapmak. Her bir fare, üç kez toplam test edilmiştir kadar tekrarlayın. </li><li> Temiz bir kafes grubu dönün ve kalan gruplar ile devam ediyor. Herhangi bir grupta üç fareden daha az varsa, bir 5 dakika arası deneme Kurtarma aralığı izin emin olun. </li><li> Ev kafesine tüm fareleri dönmek% 70 etanol ile kağıt ve temiz test ekipmanları atmayın. </li></ol></li></ol> Retina Yapının 2. Sınav <ol><li> intraperitonal ketamin enjekte (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile P30-35 hayvanları anestezi uygulayın. Kapkaççı sıkıştırarak anestezi derinliğini değerlendirmek ve IACUC kurallarına uygun olarak, sadece bir tepki yokluğunda devam edin. % 4 PFA / PBS 48 ile serpmek. </li><li> kesi si cildi temizlemek, gözleri kaldırmak içinKafatası tabanındaki deri yoluyla kesmeden önce,% 70 etanol ile te. % 70 etanol ile kafatası ve temiz açığa cilt geri soyma. temiz araçları kullanarak, dikkatle göz çukurları ulaşmak ve gözleri ortaya çıkarmak için kafatası kesti. yavaşça prizden gözü kaldırmak ve PBS içinde durulayın, optik sinir Sever. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 PFA / PBS gözleri düzeltildi. </li><li> PBS içeren küçük bir petri gözleri yerleştirin. Dikiş kaldırma makas kullanılarak kornea merkezinde küçük bir kesi yapmak. kornea ve sklera arasındaki kesme kenarı ile kornea çıkarın. iris çıkarmak için forseps kullanın. Son olarak, retina sağlam ve yerinde lensi bırakarak, RPE katmanları soyulabilir. Not:% 4 PFA / PBS tespit RPE kolayca retinanın dışından soyulmuş olması için izin RPE dekolmanı neden olur. </li><li> Yeniden düzeltme PBS içeren bir petri tabağına göz dönmeden önce% 4 PFA /% 30 sukroz, oda sıcaklığında 15 dakika süreyle / PBS. len çekinonunla birlikte vitreus vücuda getiren, forseps kullanarak s. </li><li> gece boyunca 4 ° C&#39;de% 30 sukroz içinde cryoprotect. </li><li> Taze OCT içeren bir gömme kalıp Optimum Kesme Sıcaklığı bileşik (OKT) ve transfer Coat gözler. sagital düzlem mümkün olduğunca az hareketleri kullanarak ve hava kabarcıklarının giriş kaçınarak, kesme yüzü ile paralel olacak şekilde göz yönlendirmek. Bir kuru buz / etanol banyosu içinde kalıp daldırarak flaş dondurma. -80 ° C&#39;de saklayın blokları. </li><li> Bir Kriyostat kullanarak, 20 mikron sagital bölümleri kesmek ve önceden temizlenir slaytlar üzerinde toplamak. </li><li> Standart protokollere 49 göre hematoksilen ve eozin ile Leke bölümleri. Aydınlık alan mikroskobu için donatılmış bir ışık mikroskobu kullanılarak Görüntü. </li></ol> 3. Histokimyasal Boyama <ol><li> Örnek hazırlama <ol><li> Açık damla inhalasyon yoluyla izofluran aşırı dozda (propilen glikol içinde% 30) ile P30-35 hayvanları öldürülür. kesilmesiyle ötenazi değerlendirmeknefes alma, kalp atışı ve Kapkaççı kısma yanıt eksikliği. IACUC kurallarına uygun olarak servikal dislokasyon ve organ, ölümü onaylayın. </li><li> Kafatasının tabanındaki deri yoluyla kesmeden önce,% 70 etanol ile kesi yerinde cilt temizlemek, beyin kaldırmak için. % 70 etanol ile kafatası ve temiz açığa cilt geri soyma. dikkatle kafatası kesti temiz aletleri, kullanma ve beyin maruz kaldırın. membranlar çıkarın ve yavaşça kafatası boşluğuna beyin kaldırmak. PBS içinde durulayın. </li><li> Taze OCT içeren bir gömme kalıp OCT beyin ve transfer ceket. sagital düzlem mümkün olduğunca az hareketleri kullanarak ve hava kabarcıklarının giriş kaçınarak, kesme yüzü ile paralel olacak şekilde beyin yönlendirmek. -80 ° C&#39;de bir kuru buz / etanol banyosu ve mağaza kalıp daldırarak flaş dondurma. </li><li> Bir Kriyostat kullanarak, 10 mikron sagital bölümleri kesmek ve önceden temizlenir slaytlar üzerinde toplamak. </li></ol></li> &lt;li&gt; NADH Diaphorase Boyama <ol><li> 1L-deiyonize su içinde 5.72 g Tris-HCl ve 1.66 g Tris baz çözülmesiyle, 0.05 M Tris tamponu, pH 7.6 hazırlanır. kadar altı hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> NADH çözeltisi (0.05 M Tris tamponu içinde 2.25 mM NADH) hazırlayın. -20 ° C&#39;de kısım ve mağaza. </li><li> NBT solüsyonu (0.05 M Tris tamponu içinde 2.5 mM Nitro Mavi Tetrazolyum) hazırlayın. Bir cam şişe içinde altı hafta süreyle 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> boyama çözeltisi yapma ve her bir slayt için 1 ml eklemek NADH çözeltisi ve NBT solüsyonu eşit hacimlerde bir araya getirin. 30 dakika boyunca nemlendirilmiş bir odada, 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Aspire boyama çözüm ve dH 2 O. ile üç defa yıkamak </li><li> Artan ve aseton azalan konsantrasyonlarda üç kez her yıkama / dH 2 0 (% 30,% 60,% 90,% 60,% 30), oda sıcaklığında 2 dakika karıştırıldı. </li><li> DH 2 O üç kez durulayın ve sulu ortam ile bölümleri monte edin. ışık mikroskobu kullanarak görüntü parlak f donanımlıield mikroskopi. Mavi boyama enzimatik aktiviteye karşılık gelir. </li></ol></li><li> Dehidrogenaz Histokimyasal boyanması süksinat <ol><li> 0.2 M sodyum monobazik fosfat / DH 2 O ve 0.2 M sodyum dibazik fosfat / DH 2 O hazırlanması </li><li> 20 kısım sodyum dibazik fosfat, 3 parça monobazik fosfat birleştirilmesiyle 0.2 M fosfat tamponu, pH 7.6 sağlayın. </li><li> boyama çözeltisi (0.1 M sodyum süksinat, 0.2 M fosfat tamponu içinde 1.25 M NBT) hazırlanması ve her bir slayt 1 ml. 60 dakika boyunca nemlendirilmiş bir odada, 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Aspire boyama çözüm ve DH 2 O. üç defa yıkamak </li><li> Artan üç kez her yıkama ve aseton konsantrasyonları azalan / DH 2 O (% 30,% 60,% 90,% 60,% 30), oda sıcaklığında 2 dakika karıştırıldı. </li><li> DH 2 O üç kez durulayın ve sulu ortam ile bölümleri monte edin. Aydınlık alan mikroskobu için donatılmış bir ışık mikroskobu kullanılarak Görüntü. Mavi boyama en tekabülEnzimatik faaliyet. </li></ol></li></ol>

The authors have no competing interests to disclose.

Sağlam tedaviler insan yaşlanma ile ilgili koşulları zayıflatıcı etkilerini sınırlamak için gerekli, ama onlar birçok koşulları için zor kalır. potansiyel tedavi hedefleri belirlemek ve müdahale stratejileri geliştirmek için, nedenleri ve yaşlanma ile ilişkili hastalıkların patolojisi ilk anlaşılmalıdır. Değil bu genler daha önce insan çalışmalarında durumuna bağlı olsa bile, söz konusu hastalığın ilgili net fenotipleri ile hemen mevcut tüm genetiği değiştirilmiş fareler. Bu nedenle daha sistematik araştırmalar gereklidir ve genetik olarak tadil edilmiş farenin insanlarda bağlantılı hastalıkların ilişkili olabilir fenotipleri tespit uygun deneylere tabi tutulmalıdır. Sayısız davranış testleri farelerde 50,51 nörolojik fonksiyon tahlil için var. Burada özetlenen davranış testleri insan bulgular ve gerçek fenotipleri dayalı hipotez fenotipleri uygundur obseFarelerde SVEd. Buna ek olarak, bu testler davranışsal deneyler veya çok az hatta hiç deneyimi olan laboratuvarlarda gerçekleştirmek için basittir. Orada gelişmiş donanımları için bir gereklilik olduğunu ancak sonuçlar nöromüsküler kusurlar olması bekleniyor genetiği değiştirilmiş farelerin fenotipi incelerken bir ilk adım olarak faydalı hale düzgün tahsil edildikleri anlamlı ve bilgilendirici. Elde edilen veriler, daha sonra daha gelişmiş test cihazları ile potansiyel olarak daha fazla test odak yönlendirmek için kullanılabilir. Benzer şekilde, birçok teknik dokularda 52 solunum fonksiyonunu değerlendirmek için var. ATP sentezi, oksijen tüketimi veya mitokondrial membran potansiyeli değişikliklerin hızını ölçme mitokondriyal fonksiyonun önemli okumalar vardır ama onlar karmaşık olabilir ve zaman belirli reaktifler ve ekipman 52-55 gerektiren gerçekleştirmek için alıcı. Buna ek olarak, genellikle mitochond düzeyi ile sınırlıdırRion veya hücre, kültürlü hücrelerde, lizatları veya izole mitokondri dayanarak. Histokimyasal boyama zaman veya kaynakların büyük yatırım yapmadan mitokondriyal disfonksiyon tanımlamada faydalı bir ilk adımdır. Ayrıca, doku kesitlerinde leke yeteneği kendisi ödünç hızla örneğin diğer teknikler gibi belirgin olmayabilir bölgesel farklılıkları, HtrA2 eksikliği beyinde gözlenen enzimatik boyama alanı özgü kaybı belirlenmesi için. teknik solunum kapasitesinde kat değişiklikleri ölçmek kabiliyeti sınırlı olsa da, daha sonra daha karmaşık yöntemler kullanılarak takip edilebilir tanımlanan beyin bölgeleri dışında eşler. Bu fenotiplendirme program dahilinde sunulan teknikler yapmak için basit olmakla birlikte, düzgün bazı adımları gerçekleştirmek deneylerin başarısı için kritik öneme sahiptir. davranışsal fenotipleme için büyük özen varyasyon intro sınırlamak için her gün aynı anda ve aynı yerde yapılır testleri sağlamak için alınması gerekenkonumu yenilik veya sirkadiyen ritim farkı tarafından üretilen. Ekipman benzer nedenlerle her gün aynı şekilde organize edilmelidir. Oda kuruluş yenilik küçük değişiklikler büyük ölçüde bir fare aktivitesini etkileyebilir aktivite testi için özellikle kritiktir. kavrama gücü ölçerken, araştırmacılar fareler inversiyon önce mesh uygun yere sahip olduğunu tespit etmelidir. kısa bir gecikme düşmeye karşı Benzer şekilde, bakım çarpık olacaktır düzgün arka bacak testi veya test sonuçlarında serbest bırakmadan önce yavru askıya alınmalıdır. Doku fenotipleme için, iyi bölümleri elde hayati önem taşımaktadır. diseksiyon veya eserler kesit ve diseksiyonu sırasında ortaya çıkan ve morfolojisi bozar önce retinanın bilgilendirici boyama etkili fiksasyon bağlıdır. Histokimyasal boyama beyinleri gerektirir enzim fonksiyonunu korumak için diseksiyon sonra hızla dondurulması, ama inkübasyon süresi benzer critica olduğunuL; sıcaklık ya da zaman uzunluğu küçük dalgalanmaları boyama yoğunluğuna farklılıklara neden olabilir. Mümkün olan yerlerde, örnekler grupları arasında karşılaştırma yapmak için, aynı zamanda işleme tabi tutulmalıdır. Burada yaşla ilişkili hastalıklar, yani, AMD ve PD ile ilişkili ince fenotipleri göstermesi beklenmektedir genetik olarak tadil edilmiş fareler için kullanılan bir test rejimi tarif edilmiştir. Bu fenotiplendirme programı ilgi dokuların içinde yapısal ve işlevsel kusurları nöromüsküler gücü ve aktivitede açıklarını tespit yanı sıra tanımlamak için kullanılır. Bu program, genç, genetiği değiştirilmiş farelerde erken fenotipleri sistematik bir analizini sağlar. Gelecekte, bu yöntem, aynı zamanda açık bir şekilde, normal görünen etyolojisi bilinmeyen gibi, AMD veya PD ile ilgili fenotipi ile ortaya beklenen herhangi bir genetik olarak tadil edilmiş farelere de uygulanabilir. Testlerin basitlik önemli bir yatırım yapmadan test izin verir ama daha fazla s bilgilendirmek için kullanılabilirtudies. Hücresel fenotipleme ile davranışsal test birleştirerek, kullanılan farelerin sayısını sınırlamak ve doğrudan fizyolojik durumu ile hayvan performansını karşılaştırmak mümkündür. Bu fenotiplendirme programı izleyen çalışmaların odağı yönlendirmek için kullanılan bir ilk analiz sağlar.

Yaşa bağlı hastalıklar modern toplumda giderek yaygın hale gelmektedir. tıp bilimi geliştirir ve yaşam beklentisi arttıkça, nüfus yaşlanmaya devam ve bu hastalıkların yükü büyür. Etkili tedaviler zayıflatıcı koşullarının etkisini azaltmak için gerekli olan ancak birçok durumda zor kalır. Sadece nedenlerini ve yaşlanma ile ilişkili hastalıkların patolojisi anlayarak bilim adamları müdahale stratejileri potansiyel terapötik hedefleri belirlemek ve geliştirmek için başlayabilir. Yaygın yaşla ilgili koşullar, Parkinson hastalığı (PD) ve yaşla alakalı maküler dejenerasyon (AMD) gibi nörodejeneratif bozukluklar yer alır. PD insanlarda nörodejenerasyon neden olduğu yaygın bir hareket bozukluğudur. En PD hastalar 50 yaşından sonra titreme, bradikinezi ve sertlik dinlenme gibi belirtiler gösterir. Erken başlangıçlı ayrıca vakaların yaklaşık% 10&#39;unda görülmektedir. AMD, körlüğün önde gelen nedenidir olduğunuyaşlı, giderek zarar fotoreseptör ve göz retina pigment epiteli (RPE). Merkezi görme engelli ama periferal görme genellikle etkilenmez edilir. AMD iki biçimi vardır. &quot;Kuru&quot; şeklinde, RPE ve Bruch membranı (BM) arasındaki druzen formu olarak bilinen hücre dışı protein yatakları, coğrafi atrofiye lider ve merkezi görme bulanıklığı. daha şiddetli &quot;ıslak&quot; biçim RPE ve fotoreseptör katmanlar halinde BM genelinde koroid gelen neovaskülarizasyon sonuçları ve retina dokusunun kalıcı hasara neden olan retina altında hamorrhaging yol açabilir. kromozom 1 ve 10q26 lokusu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu duyarlılık 2 (ARMS2) ve kompleman faktör H (CFH): genom dernek çalışmaları daha önce bu hastalığa artan duyarlılığı ile alakalı ve ilgi iki bölgesini tespit edilir loci belirledik yüksek sıcaklık gereksinimi faktörü A1 (HtrA1) genleri 1-5 bulunmaktadır </sup&gt;. Bu allel kombinasyonları doza bağlı bir şekilde AMD olasılığını artırır ve belirli bir SNP tercihen AMD 3-6 ıslak ya da kuru formları da ilişkilendirilebilir. CFH C3 aktivasyonunu inhibe ederek kompleman sisteminin alternatif yol (AP) bir negatif düzenleyicisi olarak işlev görür. Bir tek nükleotid polimorfizmi (SNP) nedeniyle C ikamesi 1 bir T&#39;ye histidin ile ekson 9 tirozin 402 değişimini neden AMD riski ile bağlantılı olmuştur. AMD AP nedeniyle CFH fonksiyon kaybı değil SNP bir nedensel rolü net değildir çalıp düzeni bozulmuş olduğuna inanılmaktadır. Bir hipotez pozitif yüklü histidin protein ve heparin sülfat 1,7 proteinleri-reaktif C etkileşim bağlamak için CFH yeteneğini inkâr düşünülmektedir olmasıdır. Gelen CFH Y402H in vitro çalışmalar varyantları arasında fonksiyonel farkları üzerinden çelişkili sonuçlar sağlamak, ve işi de vivo &lt;em&gt; CFH - / - hümanize CFH 8 devam etmektedir ifade fareler. Gen farelerde eksik olan, ancak ARMS2, primat genomuna HtrA1 arasında beslenir. HtrA1 bir serin proteaz, ancak ARMS2 zayıf bir şekilde karakterize edilir. AMD-ilişkili odağı SNP arasındaki bağlantı dengesizliği zor bu bölgedeki genlerin bireysel mutasyonların riskine katkılarını belirlemek amacıyla yaptığı, ancak son çalışma bu neovaskülarizasyon yol açar yerine ARMS2 daha HtrA1 aşırı ifadesi olduğunu öne sürdü ve subretinal protein mevduat 9-11. Ancak, bu lokusunda genlerin yakınlığı rastgele eklenen transgenlerin kullanılarak incelenebilir edilemez etkileşimleri izin verebilir. AMD ek olarak, serin proteazları HtrA ailesinin bir çok insan hastalığı ile ilişkilendirilmiştir. Tüm HtrA proteinler, en az bir C-terminali PDZ alan adını bir serin proteaz alanı içermektedir. HtrA1, HtrA3 ve HtrA4 gr paylaşmakbir sinyal peptidi, insülin-benzeri büyüme faktörü bağlama alanı, bir Kazal proteaz inhibitörü etki, serin proteaz alanının ve PDZ alanından oluşan eatest homoloji. HtrA2 mitokondriyal yerelleştirme dizisi, zar geçiş alanı oluşan, farklı bir N-terminusa sahip ve apopitoz bağlayıcı alan inhibitörü proteaz ve PDZ etki 12-16 eklenmiştir. Memeli HtrA1 kendi proteaz etki 17-20 aktif sitesine alt-tabaka ile indüklenen yeniden düzenlenir ve HtrA2, proteaz aktivitesi 21 bastırır serin proteaz ve PDZ etki alanları arasındaki etkileşimi modüle edilebilir. İlginç bir şekilde, PDZ alan HtrA3 16 benzer ayarlaması gerçekleştirmek için görünmez. Bu en son HtrA1 arasında bir düzenleyici bir etkileşimin var olduğunu gösterdi ve 22 protoporphyrins ve HtrA2 p38 MAP kinazın aktivasyonu ile fosforilasyon ile regüle edilebilir: HtrA proteazlar ayrıca dış faktörler tarafından kontrol edilebilirBir PINK1 bağlı bir şekilde 23 yolu. Farelerde HtrA ailesinin bireysel üyelerin silinmesi ancak mekanik etkiler çoğunlukla kısmen görünür fenotip eksikliği belirsiz, belgelenmiştir. HtrA1 protein kalitesi kontrolünde önemli bir rol oynar ve düzen bozukluğunun veya mutasyon, arterit, kanser ve AMD 3,4,24-32 riski de dahil olmak üzere bir çok farklı insana hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Hızlandırılmış nöral olmayan belirli dokular sonuçlarından da zarar 33-37, yaşlanma, nöral doku HtrA2 fonksiyon kaybı, insan ve farede PD fenotipleri ile ilişkilendirilmiştir. HtrA3 düzensizliği preeklampsi ve kanser 38,39 belirli türleri de dahil olmak üzere hastalık ile ilişkilendirilmiştir. Up-regülasyon HtrA4 bir açık fenotip 40,41 göstermez preeklampsi hastalarında ama nakavt fareler plasentada gözlenmiştir. Bazı nakavt farelerde gözlenen fenotipleri eksikliği olmuşturHtrA aile üyesi arasında tazminat bir sonucu olabileceği varsayılmıştır: Bu HtrA4 ve HtrA1 hem HtrA4 41 silinmesi üzerine HtrA1 tazminat için izin proteinlerin TGF-B ailesi ile etkileşim olduğu düşünülmektedir. Benzer şekilde, HtrA1 ve HtrA3 alan homolojiler yüksek derecede sahip oldukları için tamamlayıcı fonksiyonlar 42 sahip olabilir düşünülmektedir. Ancak, HtrA proteinleri ortak hedefleri 43 düzenlemek için yarışan, kısmen antagonistik rollere sahip olabileceği öne sürülmüştür. ayrıca bu riskini araştırmak için üç insanlaşmış knock-in fare hatları oluşturulmuştur faktörleri. CFH TM1 (CFH * 9) jhoh ve CFH tm2 (CFH * 9) jhoh, CFH geninin ekson 9. İnsan homologunun ekson 9 ile değiştirilir CFH tm1 edilir (CFH * 9) jhoh olmayan hastalıklarla ilişkili tirozin kodlar Y402H, risk ilişkili SNP taşıyan jhoh CFH TM2 (CFH * 9) ise pozisyon 402 de kalıntı. İçindeİnsan ARMS2 sekansına tm1jhoh ARMS2 HtrA1 üst akışında bir bölgeyi hedef almıştır. Gen sekansı ancak dahil UbiC promotörün aşağı yukan yerleştirilmiş bir loxP-çevrili DURDURMA dizisi, daha önce tarif edildiği gibi 34, Rosa26 promoterinin kontrolü altında Cre rekombinaz ifade OzCre farelerinin geçerek çıkarıldı. Ilave olarak, bu knock-hatları CFH ve HtrA1 (CFH tm1jhoh ve HtrA1 tm1jhoh), hem de diğer bilinen HtrA aile üyeleri için koşullu nakavt aleli elde edilmiştir: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) ve HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). Ekson 3, HtrA1;, germ-line Knockouts silme aktif etki (CFH bir çerçeve kayması ve / veya silinmesini neden böyle olduğunu loxP siteleri, belirli ekson kanadına mühendislik hayvanlara OzCre fareler geçerek oluşturulan ekson 2Ekzon 2-4, HtrA3;: HtrA2, -3 ekson 3, HtrA4; 4-6) 34,41 eksondan. HtrA2 bir nöral silinmesi, Nestin promoterinin kontrolü altında Cre rekombinaz kullanılarak silindi (HtrA2 flox Tg (Nes-CRE) 1Kln / J) de 34 tanımlanmıştır. HtrA2 eksik olan tek farenin, sistemik ya da nöronal dokuda, Parkinson fenotip sergileyen açık fenotipleri göstermiştir. Çevrede bu genlerin bir kısmı mitokondri 11,44-47 lokalize edilmesi oturtulması ve HtrA2 silinmesi Parkinson fenotipleri, mitokondriyal ve nörolojik odaklı bir fenotipleme rejimi Burada anlatılan ve ilgi testlerinden Örnek sonuçlar verilmiştir oluşturulacak yana . iki ile ilgili deneylerin bir dizi oluşan sistematik bir başlangıç ​​fenotipleme zamanlama kurulmuş iyice insan, yaşla ilgili hastalığın tespitinde ve üretilen genetik olarak fareler incelemek amacıylailgi hastalıkları: AMD ve Parkinson.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1218">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Ethanol</td>
			<td style="width:221px;">Decon (Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:260px;">435541</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1443222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cotton balls</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heat mat</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>0000756-500-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Holding tray (ice cube tray)</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electronic stopwatch</td>
			<td>GOGO</td>
			<td>PC396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plexiglass box</td>
			<td>constructed in workshop</td>
			<td></td>
			<td>12&#34; by 12&#34;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vixia HF R400 Camcorder</td>
			<td>Canon</td>
			<td>8155B004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">9oz Clear Cups</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/4 inch wire mesh</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>204331884 (online) / 554219 (in store)</td>
			<td>12&#34; by 12&#34;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bubble wrap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470092-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Straight specimen forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine-tip dissecting forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x phosphate buffered saline pH 7.4</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB11072-04000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">superfrost slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematoxylin Stain Solution</td>
			<td>Fisher Scientific (Ricca)</td>
			<td>353016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eosin Y Stain Solution</td>
			<td>Fisher Scientific (Ricca)</td>
			<td>2845-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02000-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrotetrazolium Blue chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9006-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VectaMount aqueous mounting medium</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-5501-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-M</td>
			<td>60 x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AxioImager A1 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Video camera tripod</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optimal Cutting Temperature (OCT)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>23730571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat Sectioning&#160; Machine</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>CM1900</td>
			<td>Discontinued but since replaced by CM1950</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a phenotyping regimen for genetically modified mice used to study genes implicated in human diseases of aging

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson's. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.

Bu bölüm, bu yöntemler kullanılarak elde edilebilen sonuçları örnekleri verilmektedir. arka ekstremite testinde, çekme deneme sayısı yapılmış ve gecikme her gün için iki ardışık testleri üzerinde toplanır düşmeye. . Bu test azaltılmış nöromusküler gücü HtrA2 tm1jhoh ile fareler ayırt etmek genetik olarak farklı grupları karşılaştırmak için kullanılabilir (HTRA2 KO) Şekil 1A fareler - B P4-6 bir azalma ardından düşmeye çeker ve gecikme sayısında hiçbir değişiklik göstermektedir litermatında (HTRA2 WT) ile karşılaştırıldığında, P7-10 nöromüsküler gücü bölgesi. yaş mukavemet beklenen artış, yabani tip hayvanlardaki gözlemlenebilir. sütten kesilmiş gözlem test için toplam etkinlik, test üç gün üst üste genelinde ortalama (satır yetiştirme ve olayları damat, geçilen) tüm etkinlikleri toplanmasıyla değerlendirilebilir. Alternatif olarak, olayın her özel tip individuall olabiliry analiz. Burada Örnek sonuçlar WT littermates göre HTRA2 KO farelerde düşük aktivitesi gösteren sunulmaktadır. Bu veriler, toplam aktivitesi nicel ölçüldü ve grup (Şekil 1C) arasında karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir. Her test gününde gerçekleştirilen üç tekrarlar günlük ortalama hesaplanarak kavrama kuvveti farklılıkları ölçmek için de mümkündür. HTRA2 KO fareler yavru kontroller ile karşılaştırıldığında, daha kısa gecikme tezahür gücü azalma (Şekil 1D) düşmeye. Retina, H &amp; E boyama retinal yapıyı incelenmiş ve (Şekil 2) göre edilebildiği görüntüler üretir. retina oluşturan hücre tipleri katmanları açıkça genetik gruplar arasında karşılaştırma sağlayan belirginlik. Burada, HtrA2 tm1jhoh &#39;; HtrA3 tm1jhoh farenin HtrA2 kıyasla retina yapısında herhangi bir değişiklik gösteren <sup&gt; WT; P35 de HtrA3 tm1jhoh fareler. Son olarak, elektron taşıma zinciri kompleksi etkinliği için histokimyasal boyama gibi beyincik ve HtrA2 striatumunda gözlenen azalma olarak artış, enzim aktivitesi, yansıtma boyama yoğunluğuna artışlarla, solunum enzim fonksiyonları değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir flox / flox Tg (Nes WT littermates (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında -cre) 1Kln / J (Nesko) beyin. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54136/54136fig1.jpg" /> Şekil 1:. Genetik olarak farelerin davranış fenotipleme HtrA2 tm1jhoh (HTRA2 KO) farelerde (HTRA2 WT) yavru kontroller yabanitip ile kıyasla tarif davranış testi tabi tutuldu. (A - B) arka bacak süspansiyon test P4-P10 gelen WT ve KO, yenidoğanlarda gerçekleştirilen ve nöromusküler bir azalma gösterir olduKO hayvanlarda gücü (WT: n = 28, KO: n = 19). (A) KO yavrular başlangıçta WT kardeşler olarak çekme girişimleri benzer sayıda yapmak, ancak daha sonra zaman noktalarında yapılan girişimler bir düşüş göstermektedir. Düşmeye (B) KO yenidoğanlarda &#39;gecikme de başlangıçta normaldir ama itibaren P7 azalır. (N = 12 WT: n = 19, KO) (C) sütten kesilmiş gözlem toplam aktivite skoru, bu farelerin aktivitesi azaltılmış uyumlu WT litermatlarından karşılaştırıldığında KO hayvanlarda indirgendi. (D) KO hayvanlar da HTRA2 KO fareleri azaltılmış kavrama gücü gösteren, kafes ters test sırasında düşmeye azaltılmış gecikme vardı (WT: n = 17, KO: n = 9). Veri ortalama ± SEM temsil (# 0.1 &lt;p &lt;0.05, * p &lt;0.05, ** p &lt;bağımsız t-testi ile 0.001, *** p &lt;0.001). Bu rakam Patterson ve ark gelen modifiye edilmiştir. 34 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54136/54136fig1large.jpg" target="_blank">görüntülemek için tıklayınız</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonu. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54136/54136fig2.jpg" /> Şekil 2:. Retinanın H &amp; E boyama hematoksilen ve eozin ile boyama retina bölümleri retina katmanları ortaya koymaya, yapının incelenmesini sağlar. P35 HtrA2 WT burada bölümler, HtrA3 tm1jhoh (A) ve HtrA2 tm1jhoh; HtrA3 tm1jhoh (B) ekran normal retinal yapısı. RPE: retina pigment epiteli, OS: dış kesimleri, IS: iç kesimleri, onl: dış nükleer tabaka, OPL: dış pleksiform katman, INL: iç nükleer tabaka, IPL: iç pleksiform tabakası, GCL; Ganglion hücre tabakası. Ölçek çubuğu = 1 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54136/54136fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> . Şekil 3: Tg (Nes-CRE) 1Kln / J (Nesko) ve Solunum karmaşık aktivite NADH Diaphorase (kompleks I) ve süksinat dehidrogenaz (karmaşık II) faaliyet için histokimyasal boyama P25 HtrA2 enine beyin kesitlerinde flox / flox yapıldı HtrA2 + / flox Tg (Nes-CRE) 1Kln / J (NesWT) yavrular. NADH diaforaz enzim aktivitesi beyincik (Crbl, B) ve NesWT kontrol (A, C) ile karşılaştırıldığında Nesko beynin striatum (D) &#39;de azalmıştır, ancak değil serebral korteks (E - E). SDH aktivitesi benzer NesWT kontrollerle karşılaştırıldığında Nesko farelerin beyincik ve striatum (H, J) (G, I) azalır, ancak serebral korteks değişiklik yoktur (K - L). Ölçek çubuğu = 200 mikron. BuŞekil Patterson ve ark., 34 modifiye edilmiş <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54136/54136fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging at JoVE.com

A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging

A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.

Yaşlanma İnsan Hastalıkları karıştığı Genler Eğitim için kullanılır Genetiği Değiştirilmiş Fareler için Fenotiplendirme Rejimi

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to ...

a-phenotyping-regimen-for-genetically-modified-mice-used-to-study

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

8.2K Görüntüleme.  Yale University School of Medicine. A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.

Video: A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging

Modified Technique for Coronary Artery Ligation in Mice

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI we need better knowledge about pathophysiology of myocardial ischemia. This knowledge may be valuable to define new therapeutic targets for innovative cardiovascular therapies4. Experimental MI model in mice is an increasingly popular small-animal model in preclinical research in which MI is induced by means of permanent or temporary ligation of left coronary artery (LCA)5. In this video, we describe the step-by-step method of how to induce experimental MI in mice.
The animal is first anesthetized with 2% isoflurane. The unconscious mouse is then intubated and connected to a ventilator for artificial ventilation. The left chest is shaved and 1.5 cm incision along mid-axillary line is made in the skin. The left pectoralis major muscle is bluntly dissociated until the ribs are exposed. The muscle layers are pulled aside and fixed with an eyelid-retractor. After these preparations, left thoracotomy is performed between the third and fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The proximal segment of LCA artery is then ligated with a 7-0 ethilon suture which typically induces an infarct size ~40% of left ventricle. At the end, the chest is closed and the animals receive postoperative analgesia (Temgesic, 0.3 mg/50 ml, ip). The animals are kept in a warm cage until spontaneous recovery.

The surgical procedure used to induce experimental myocardial infarction in mice begins with left thoracotomy between the third and the fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The left coronary artery is ligated, the chest is closed and the mouse is allowed to recover spontaneously.

Fare Koroner Arter Ligasyonu için Modifiye Tekniği

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI ...

Tıp

The Goeckerman Regimen for the Treatment of Moderate to Severe Psoriasis

Psoriasis is a chronic, immune-mediated inflammatory skin disease affecting approximately 2-3% of the population. The Goeckerman regimen consists of exposure to ultraviolet B (UVB) light and application of crude coal tar (CCT). Goeckerman therapy is extremely effective and relatively safe for the treatment of psoriasis and for improving a patient's quality of life. In the following article, we present our protocol for the Goeckerman therapy that is utilized specifically at the University of California, San Francisco. This protocol details the preparation of supplies, administration of phototherapy and application of topical tar. This protocol also describes how to assess the patient daily, monitor for adverse effects (including pruritus and burning), and adjust the treatment based on the patient's response. Though it is one of the oldest therapies available for psoriasis, there is an absence of any published videos demonstrating the process in detail. The video is beneficial for healthcare providers who want to administer the therapy, for trainees who want to learn more about the process, and for prospective patients who want to undergo treatment for their cutaneous disease.

Psoriasis is a chronic, immune-mediated inflammatory skin disease. The Goeckerman regimen, formulated for the treatment of psoriasis, consists of exposure to ultraviolet B (UVB) light and application of crude coal tar (CCT). The following protocol is for the administration of Goeckerman therapy for the treatment of moderate-to-severe psoriasis.

Şiddetli Sedef için Orta Tedavisinde Goeckerman Kürü

Psoriasis is a  chronic, immune-mediated inflammatory skin disease affecting approximately 2-3%  of the population. The Goeckerman regimen consists of ...

Measuring Frailty in HIV-infected Individuals. Identification of Frail Patients is the First Step to Amelioration and Reversal of Frailty

A simple, validated protocol consisting of a battery of tests is available to identify elderly patients with frailty syndrome. This syndrome of decreased reserve and resistance to stressors increases in incidence with increasing age. In the elderly, frailty may pursue a step-wise loss of function from non-frail to pre-frail to frail. We studied frailty in HIV-infected patients and found that ~20% are frail using the Fried phenotype using stringent criteria developed for the elderly1,2. In HIV infection the syndrome occurs at a younger age.
HIV patients were checked for 1) unintentional weight loss; 2) slowness as determined by walking speed; 3) weakness as measured by a grip dynamometer; 4) exhaustion by responses to a depression scale; and 5) low physical activity was determined by assessing kilocalories expended in a week's time. Pre-frailty was present with any two of five criteria and frailty was present if any three of the five criteria were abnormal.
The tests take approximately 10-15 min to complete and they can be performed by medical assistants during routine clinic visits. Test results are scored by referring to standard tables. Understanding which of the five components contribute to frailty in an individual patient can allow the clinician to address relevant underlying problems, many of which are not evident in routine HIV clinic visits.

Frailty syndrome is commonly seen in the aged and reflects multi-system physiological change. However, with reduced functional reserve and resilience frailty is also known to be common in the HIV infected population. This study outlined an easily administered screening test to identify HIV patients with frailty. When significant components of frailty are identified, clinicians will be able to focus on amelioration of the problem and promote reversion to the pre-frail state.

HIV ile enfekte Bireylerde Frailty ölçüm. Narin Hastalar tanımlanması Islahı ve Frailty iptali için ilk adımdır

A simple, validated protocol consisting of a battery of tests is available to identify elderly patients with frailty syndrome. This syndrome of decreased ...

Collecting Saliva and Measuring Salivary Cortisol and Alpha-amylase in Frail Community Residing Older Adults via Family Caregivers

Salivary measures have emerged in bio-behavioral research that are easy-to-collect, minimally invasive, and relatively inexpensive biologic markers of stress. This article we present the steps for collection and analysis of two salivary assays in research with frail, community residing older adults-salivary cortisol and salivary alpha amylase. The field of salivary bioscience is rapidly advancing and the purpose of this presentation is to provide an update on the developments for investigators interested in integrating these measures into research on aging. Strategies are presented for instructing family caregivers in collecting saliva in the home, and for conducting laboratory analyses of salivary analytes that have demonstrated feasibility, high compliance, and yield quality specimens. The protocol for sample collection includes: (1) consistent use of collection materials; (2) standardized methods that promote adherence and minimize subject burden; and (3) procedures for controlling certain confounding agents. We also provide strategies for laboratory analyses include: (1) saliva handling and processing; (2) salivary cortisol and salivary alpha amylase assay procedures; and (3) analytic considerations.

We demonstrate: (1) procedures for collection of salivary samples in cognitive impaired older adults by family caregivers in the home setting, (2) procedures for measuring stress activity via salivary cortisol and alpha amylase, and (3) representative profiles. Protocols that allow researchers to study stress-linked processes advance our understanding of biological sensitivity and susceptibility.

Salivary measures have emerged in bio-behavioral research  that are easy-to-collect, minimally invasive, and relatively inexpensive  biologic markers of ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Bir Modifiye Yağış Yöntemi İdrar eksozomlar yalıtmak için

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

Construction of Vapor Chambers Used to Expose Mice to Alcohol During the Equivalent of all Three Trimesters of Human Development

Exposure to alcohol during development can result in a constellation of morphological and behavioral abnormalities that are collectively known as Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). At the most severe end of the spectrum is Fetal Alcohol Syndrome (FAS), characterized by growth retardation, craniofacial dysmorphology, and neurobehavioral deficits. Studies with animal models, including rodents, have elucidated many molecular and cellular mechanisms involved in the pathophysiology of FASDs. Ethanol administration to pregnant rodents has been used to model human exposure during the first and second trimesters of pregnancy. Third trimester ethanol consumption in humans has been modeled using neonatal rodents. However, few rodent studies have characterized the effect of ethanol exposure during the equivalent to all three trimesters of human pregnancy, a pattern of exposure that is common in pregnant women. Here, we show how to build vapor chambers from readily obtainable materials that can each accommodate up to six standard mouse cages. We describe a vapor chamber paradigm that can be used to model exposure to ethanol, with minimal handling, during all three trimesters. Our studies demonstrate that pregnant dams developed significant metabolic tolerance to ethanol. However, neonatal mice did not develop metabolic tolerance and the number of fetuses, fetus weight, placenta weight, number of pups/litter, number of dead pups/litter, and pup weight were not significantly affected by ethanol exposure. An important advantage of this paradigm is its applicability to studies with genetically-modified mice. Additionally, this paradigm minimizes handling of animals, a major confound in fetal alcohol research.

We demonstrate the construction of alcohol vapor chambers using readily available materials that simultaneously house 6 mouse cages. We further describe their use in a mouse model of fetal alcohol exposure equivalent to all 3&#160;trimesters of human pregnancy. This paradigm exposes animals during gestation and postnatal days 1-12.

İnsani Gelişim her üç trimesterde Eşdeğeri sırasında Alkol Fare Expose Kullanılan Buhar Odaları İnşaatı

Exposure to alcohol during development can result in a constellation of morphological and behavioral abnormalities that are collectively known as Fetal ...

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.

This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

Nörolojik Hastalıklar Çalışmaları Yaratma ve Kullanma hiPSC Türetilmiş NPC A Guide

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Farelerde Hızlandırılmış Ateroskleroz Indüksiyonu: "Tel-Yaralanma" Modeli

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Fosfor-31 Manyetik Rezonans Spektroskopisi: Ölçme için Aracı<em&gt; İn Vivo</emİnsan İskelet Kası içinde&gt; Mitokondriyal Oksidatif Fosforilasyon Kapasitesi

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...