This work was supported by grants from the Academic Research Fund of the Ministry of Education, and the National Medical Research Council and the National Research Foundation, Singapore.

A. Biyofilm Oluşumunun 1. Kristal Violet Kantifikasyonu baumannii S1 <ol><li> A. 5 ml&#39;lik bir kültür büyütün lizojeni suyu içinde baumannii S1 (LB) 16 saat süre ile bir çalkalama inkübatöründe (220 rpm) 30 ° C&#39;de (tripton 10 g / L, bira mayası özütü 5 g / L). </li><li> A. kültürünü ayarlayın istenen OD 0.8 600 baumannii S1. Bir 96-yuvalı plaka kullanarak, bakteri kültürünün aşılanması: saflaştırılmıştır GKL enzim (40 mg / ml) 10 ul ihtiva eden taze LB (1 100 seyreltme); Yeni kültürün nihai hacim 100 ul olduğunu. </li><li> Hem de bir kontrol kültürü hazırlayın; Bu herhangi bir enzim içermez. Çoğaltır istenen sayıda elde etmek için benzer koşullar tekrarlayın. </li><li> Bir kapak ile plaka örtün ve sızdırmaz şekilde kapalı bir 10 litrelik plastik bir kap içine koyun. Ortamı yavaşça çıkarmadan önce 3 saat süre ile 30 ° C &#39;de plaka inkübe edin. </li><li> Oyuk taze LB ortamı bir 100 ul ilave edin ve 30 ° C&#39;de 21 saat boyunca inkübe plaka. </li&gt; <li> Inkübasyon ikinci döneminden sonra, yavaşça tüm ortamı çıkarın. 200 ul steril su ile planktonik bakteri hücresini yıkayın. Yıkama sırasında hücrelere sadece minimal rahatsızlık olduğundan emin olun. </li><li> Her çukuruna% 1 kristal viyole çözeltisi 100 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. 200 ul steril su ile kuyusunu yıkayarak kristal viyole çözüm çıkarın. Iki kez yıkama tekrarlayın. </li><li> Her çukuruna% 33 asetik asit, 100 ul eklenir ve yavaşça çalkalanarak 15 dakika boyunca inkübe edilir; Bu boya eriyecektir. </li><li> 600 nm &#39;de kristal viyole absorbansı ölçülerek oluşan biyofilm miktarının belirlenmesi. Kristal viyole miktarı oluşturulmuş, biyofilm miktarı ile orantılıdır. </li></ol> A. 2. konfokal lazer tarama mikroskobu baumannii S1 Biyofilm <ol><li> A. 5 ml&#39;lik bir kültür büyütün 16 saat süre ile bir çalkalama inkübatöründe (220 rpm) 30 ° C&#39;de LB baumannii S1. </li><li> ReklamA. sadece kültür istenen OD 0.8 600 baumannii S1. 35 mm bir cam tabanlı μ-çanağı kullanılarak, bakteri kültürünün aşılanması: saflaştırılmıştır GKL enzim (40 mg / ml) 30 ul ihtiva eden taze LB (1 100 seyreltme); Yeni kültürün nihai hacmi 1 ml olmuştur. </li><li> Kapaklı μ-Dish Kapak ve mühürlü 10 litrelik plastik kaba koyun. Ortamı yavaşça çıkarmadan önce 3 saat süre ile 30 ° C &#39;de μ-Bulaşık inkübe edin. 1 ml &#39;lik bir toplam hacme getiren saflaştırılmıştır GKL enzim ve taze ortam 30 ul ekle. 30 ° C&#39;de bir 21 saat daha inkübe edilir. </li><li> Adımı yineleyin 2.3 ve 30 ° C sıcaklıkta bir 24 saat μ-Dish kuluçkaya yatmaktadır. Sonra, yavaşça ortamı çıkarın. </li><li> Μ-çanağı Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde eritildi 5 ug / ml Alex Fluo 488-konjuge Buğday tohumu aglutinini (WGA) 500 ul ilave edin ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin; Bu oluşan biyofilm leke olacaktır. T boyama çözüm çıkarın ve yıkayınO u-Dish HBSS 2 ml. Yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın. </li><li> % 3.7 formaldehit HBSS içinde çözüldü ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe 500 ul ilave et; Bu μ-Dish üzerine biyofilm çözecektir. HBSS 2 ml ile bir kez μ-bulaşık yıkama ve daha sonra tamamen uzaklaştırın. Μ-Bulaşık biyofilm sabit önceden CLSM görüntüleme 4 ° C de karanlıkta tutulmuşlardır edilebilir. </li><li> CLSM görüntüleme ve analiz için yığının başına 0.21 mikron arayla görüntü başına 97 yığınlarının oluşturmak için 63 kat büyütme kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antibiotics:+are+we+in+the+post-antibiotic+era?.">Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era?.</a> Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).</li><li>Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+future+prospects+of+antivirulence+therapies.">The biology and future prospects of antivirulence therapies.</a> Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).</li><li>LaSarre, B., Federle, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+quorum+sensing+to+confuse+bacterial+pathogens.">Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).</li><li>Waters, C. M., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing:+cell-to-cell+communication+in+bacteria.">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li><li>Rasko, D. A., Sperandio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-virulence+strategies+to+combat+bacteria-mediated+disease.">Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease.</a> Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).</li><li>Lazar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+in+biofilms--how+to+destroy+the+bacterial+citadels+or+their+cohesion/power?.">Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power?.</a> Anaerobe. 17, 280-285 (2011).</li><li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Biofilms:+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections.">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Perez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+challenge+of+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii.">Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).</li><li>Tay, S. B., Yew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+quorum-based+anti-virulence+therapeutics+targeting+Gram-negative+bacterial+pathogens.">Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens.</a> International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).</li><li>Igarashi, J., Suga, H., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+19.">Ch. 19.</a> Quorum Sensing. 692, 265-274 (2011).</li><li>Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+phosphotriesterase-like+lactonase+from+Sulfolobus+solfataricus+and+its+immobilization+for+disruption+of+quorum+sensing.">Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing.</a> Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).</li><li>Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+quorum+sensing+in+the+pathogen+Acinetobacter+baumannii+using+non-native+N-Acyl+homoserine+lactones.">Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones.</a> ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).</li><li>Chow, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+thermostable+quorum-quenching+lactonase+from+the+amidohydrolase+superfamily.">Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).</li><li>Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+biofilm+formation+by+the+human+pathogen+Acinetobacter+baumannii+using+engineered+quorum-quenching+lactonases.">Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).</li><li>Pour, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+Acinetobacter+baumannii+strains+isolated+from+urinary+tract+infection+and+urinary+catheters.">Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters.</a> FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Deney iki seti olarak, A. baumannii S1 bakteriler 15 tarafından oluşturulan biyofilm miktarını azaltabilir yüksek tuz konsantrasyonu olarak NaCl&#39;siz LB ortamında kültive edilmiştir. Bu tür eserin varlığı oluşturduğu biyofilm miktarını, hem de farklı tedavi koşulları arasında nisabı-söndürme enzimlerin etkisini hafife olabilir. Katalitik inaktif enzim kullanımı enzim sekestrasyonun olası etkilerini ortadan kaldırmak için bir negatif kontrol olarak önemlidir. Inaktif enzimler, çekirdek molekülleri ayırmak bile Şekil 1&#39;de görüldüğü gibi, biyofilm oluşumu kesintiye değildir. A. baumannii S1 96 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu içinde hava ve sıvı arayüzü arasında hassas bir halka benzeri biyofilm yapısı oluşturur. Dolayısıyla, bakteri biyofilmlerin tesadüfi kaldırılmasını önlemek için medya çıkarma ve yıkama adımları sırasında aşırı ajitasyon önlemek için çok önemlidir. LB ortamı, her bir inkübasyondan sonra çıkarıldıplanktonik hücreler ortadan kaldırır. Buna ek olarak, 96 kuyucuklu plak hava akımı meydana gelen pertübasyonları en aza indirmek ve biyofilm oluşumunu destekleyen bir mikro anaerobik ortam oluşturmak için bir 10 litrelik plastik kap içine yerleştirilmiştir. Bir 96-yuvalı plaka içinde Biyofilm kantitatif da her oyuğa ilave kristal viyole miktarına bağlıdır. Aşırı kristal viyole kuyuya ilave edilmesi halinde, yıkama adımları sayısı arttırılabilir. Kristal viyole boyama deneme biyofilm bozulmasına nisabı-söndürme verimliliği göreceli bir karşılaştırma sağlar. Kristal viyolet biyofilm oluşumunu ölçmek için niceliksel olmasına rağmen, sadece çekirdek giderici enzimlerin katalitik etkinlik açısından yarı kantitatif. Doğru istatistiksel karşılaştırma için yeterli örneklem büyüklükleri farklı tedavi grupları için önemlidir. Uç da sonuçların hatalı biçimde önlemek için kaldırılmalıdır. Konfokal görüntüleme ve bakteriyel biyofilm analizi usef olannisap-söndürme enzimlerin nitel etkilerinin değerlendirilmesi için ul aracı. Kullanıcı (aktif veya inaktif) uygulanan nisap-söndürme enziminin Çeşidi farkında Ancak, analiz için biyofilmi seçme süreci önyargı için potansiyel bir kanal olabilir. Önyargı olasılığını önlemek için, deney kullanıcıdan enzim bilgileri hariç veya seçim için rasgele bir yaklaşım kullanmak üzere tasarlanmış olabilir. Tarafsız bir seçim stratejisi de CLSM tarafından biyofilm morfolojileri iyi niceliksel karşılaştırılmasına olanak sağlamaktadır. Bununla birlikte, bu bakteriyel biyofilmlerin ilgili çekirdek giderici enzimlerin sonucunu değerlendirmek için bir yöntem tarif ilk çalışmadır. Kristal viyole boyama biyofilm bozulmasına nisabı-söndürme enzimlerin programı gösterdi ve enzimin modi operandorum hücre sayıları ve virulans faktörü ekspresyonunu azaltarak sınırlı olmadığını ortaya çıkarmıştır. Bu arada, CLSM analizi ile belirlenen morfolojik değişiklikler de mümkündür Moleküller içgörüler sağlayabilirBu enzimlerin ar hedefler. Geçerli deney bakteriyel biyofilm üzerindeki enzimler ön etkilerini araştırmak amacıyla tasarlanmış olmasına rağmen, protokol bakteriyel büyüme sonrasında enzimi ekleyerek önceden oluşturulmuş biyofilm üzerinde enzimin etkisini değerlendirmek için veya serum kullanımı yoluyla fizyolojik koşullar altında yetkinliğini incelemek için modifiye edilebilir kültürü için benzeri koşullar. GKL enzimleri incelemek için kullanılan protokol biyofilm bozulması onların ilişkiyi araştırmak için başka nisap giderici enzimler ve patojenlere uzatılabilir.

Bulaşıcı hastalıklar için tedavi seçenekleri, antibiyotik ilaçlar 1 bir geniş bağışıklık çok ilaca dayanıklı bakterilerin hızlı artışın daha karmaşık bir. Dirençli bakteri kaynaklı enfeksiyonlardan yüksek morbidite ve mortalite oranları ile, ilaç geliştirme süreçlerini yükselmek ve / veya tedavi seçenekleri geliştirmek için daha iyi anti-bakteriyel alternatifleri keşfetmek için bir ihtiyaç vardır. Son zamanlarda, anti-virülans yaklaşımı dolayısıyla direnç mekanizmaları 2 risklerini azaltmaya olmayan bakteri yöntemlerle virülansını önlemede potansiyeli verilen faiz kazanıyor. Nisabı algılamalı bakteriyel virülans ve bu sinyal olgusunun bozulması bir &#39;ana şalteri&#39; patogenezinde 3 karşı vadeden bir anti-virülans yöntemdir olduğunu. Kritik bakteriyel nüfus yoğunluğu ulaşıldıktan sonra virülansına başlangıcı dışı ortamda nisabı moleküllerin birikimini gerektirir. As quoROM molekülleri, komşu reseptörlerine bağlanma hastalık oluşturma faktörlerinin aktivasyonu gibi antibiyotik direnci ve biyofilm 4 ile ilişkili genlerin yol açar, hücre içi matris geri yayılır. Genel, nisap algılama bozulması Birincil metabolik etkilemeden nisabı molekülü ve reseptör etkileşimi inhibe içerir. Bu nedenle, hücre büyümesi üzerinde doğrudan bir ima yoktur. Fitness tehlikeye olmadığından, gelişmeye ve bu tür tedaviler 5 karşı direnç kazanmak için bakteriler için en az seçim baskı var. Buna ek olarak, çekirdek-algılama bozulması, anti-bakteriyel maddeler karşı koruma sağlar ve immün yanıtları ana biyofilm, olduğu gibi, doğal bakteri koruyucu mekanizmaların engelleyebilir. Bu Dünya&#39;da mikropların% 99 th içinde yaşayan mikroorganizmalar için çok önemli hayatta kalma avantajı kazandıran, karmaşık biyofilm gibi matrisler var olduğu tahmin edilmektedirese yapılar 6. Daha da önemlisi, bu sesil etki oluşumu en kalıcı ve kronik hastane kökenli enfeksiyonların 7 nedenidir. Acinetobacter baumannii küresel hastane kökenli enfeksiyonlarla ilişkilidir ve virülans büyük ölçüde yeterli çoğunluk algılama atfedilir Belli başlı insan patojenleri biridir aracılı biyofilm oluşumu 8. Çekirdek giderici enzimler, Gram-negatif bakterilerin 9 tarafından üretilen N -asil homoserin laktonlar (AHL&#39;ler) olarak bilinen bir bileşikler grubu hedef, çekirdek-kaynaklı sinyal transdüksiyonunun bozulması başarıyla kullanılmıştır. Çeşitli çalışmalar da biyofilm 10,11 virülans faktörü ekspresyonu ve hücre sayılarının azaltılması yoluyla bakteriyel hastalık oluşumunun engellemek için bu enzimlerin kullanımına bağlı genişletmiştir. Ne yazık ki, bakteriyel patojenler tarafından biyofilm oluşumuna karşı nisabı-söndürme enzimlerin etkin kullanımı palpabl gösteri eksikliği kalır.Yeniden A. bozmaya, nisap inhibitörleri (AHL analogları), yerine nisabı giderici enzimler kullanmayı girişimleri olmuştur baumannii biyofilm oluşumu 12. Küçük moleküller inhibitörleri kullanılarak bu yöntem, geçerli bir yaklaşım olsa da, translasyon kullanımlarda, bio-mevcudiyetini sürdürülmesi zor olabilir. Enzimler terapötik etkileri için biyomedikal cihazların yüzeylerine immobilizasyon doğru daha uygundurlar Aksine, katalitik çekirdek giderici enzimlerin kullanılması biyolojik sorunu aşmak olabilir. Burada, kristal viyole boyama ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanarak, Geobacillus kaustophilus (GKL) bakteriyel biyofilm oluşumu üzerinde 13&#39;ten mühendislik nisap-söndürme lactonases etkilerinin bir değerlendirmesini açıklar. Bu çalışma klinik olarak anlamlı A. biyofilm bozulması ilk başarılı gösteri nisap giderici enzimler kullanılarak baumannii S1 süzün. Yöntem tarifBu çalışmada, patojenik Gram-negatif bakterilere karşı sonraki terapötik geliştirme çabaları diğer çekirdek giderici enzimlerin etkinliğini değerlendirmek için yararlıdır.

<table><tbody><tr><td>Tryptone&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Costar</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6158</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Lab-Scan</td><td>PLA00654X</td><td>Caution: Flammable</td></tr><tr><td>&amp;mu;-Dish</td><td>Ibidi</td><td>80136</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluo 488-conjugated WGA</td><td>Invitrogen</td><td>W11261</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>141475095</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Caution: Corrosive&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Synergy HT Microplate Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X-81 Inverted Fluorescence Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

anti-virulent disruption of pathogenic biofilms using engineered quorum-quenching lactonases

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm's tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.

Doğal tipte GKL ve geliştirilmiş GKL çift mutant (E101G / R230C) kristal viyole niceleme deneyde, iki çekirdek giderici enzimler biyofilm oluşumunu kesintiye uygulanabilirliğini göstermek için kullanılmıştır. Her iki enzim karşı lactonase etkinliğini göstermek için gösterilmiştir 3-hidroksi-dekanoyil-L-homoserin lakton (3-OH-Cı 10 -HSL), A. kullandığı başlıca çekirdek molekülün baumannii S1 14. Biyofilm bozulma geçerli bir değerlendirme için, (daha önce AHL ligandları tecrit olmayan gösterilmiştir) kendi katalitik aktif enzimler aynı zamanda anında kontroller (GKL D266N mutant ve GKL E101G / R230C / D266N mutant) olarak alındı. Yabani tip A kullanılmasının yanı sıra baumannii S1, bir mutan Δ Abai suşu (AHL sentaz eksikliği) biyofilm oluşturma yeteneği de test edilmiştir. Çekirdek giderici enzimler, doğal tipte GKL ve GKL E101G / R230C mutant Hem anlamlı öncesi biyofilm oluşumunu azaltmak mümküntedavi A. baumannii S1 kültürleri (n = 10; 0.0001 ≤ p-değeri) (Şekil 1). Bununla birlikte, her iki enzim için biyofilm bozulma derecesi 3-OH-Cı 10 -HSL karşı etkinlikleri orantılı değildir. GKL E101G / R230C mutant devir hızı (k kedi) 3-OH-C 10 -HSL 14 karşı yabani tip GKL altı kat daha hızlıdır. Ancak, enzimler arasındaki biyofilm bozulması ölçüde farklılık sadece iki yönlüdür. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53243/53243fig1.jpg" /> Şekil 1. A. baumannii biyofilm bozulması deneyi. biyofilm oluşturma kristal mor boyama ile ölçülmüştür. Kırmızı sütunlar vahşi tip A. tarafından oluşturulan biyofilm miktarını temsil çekirdek giderici lactonases ilavesi olmadan baumannii ve Δ Abai mutantı. Mavi sütunlar amo temsilvahşi tip A. tarafından oluşturulan biyofilm unt inaktif GKL D266N mutantın doğal tip GKL inaktif GKL E101G / R230C / D266N mutantı ve GKL E101G / R230C mutant: Dört farklı GKL enzimlerin varlığında baumannii. **** P- ≤ 0.0001 değeri. Antimikrobiyal Ajanlar ve Kemoterapi 58 izni ile çoğaltılmıştır, 1802-1805 (2014). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53243/53243fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> A. Konfokal görüntüleme baumannii S1 biyofilm oluşumu bu sesil alanların yapısal morfolojisi, çekirdek-söndürme etkileri nitel ve nicel ölçü sağlamak için kullanıldı. Geliştirilmiş GKL E101G / R230C mutant ve zeolitler katalitik açıdan inaktif enzim karşılaştırma için kullanıldı. Diferansiyel görüntü kontrastı (DIC) görüntüsü (geliştirilmiş GKL E101G / R230C mutant ile tedavi, biyofilm boyutunda bir azalmaya neden olduğunu gösterdi Figüre 2). Floresans görüntüleri analiz da geliştirilmiş GKL E101G / R230C mutant (Tablo 1) ile tedavi edildiğinde yüzey alanı, biyokütle ve biyofilm ortalama kalınlıkta azalma olduğunu göstermiştir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53243/53243fig2.jpg" /> A. Şekil 2. Temsilcisi konfokal lazer tarama mikroskobu görüntüleri baumannii biyofilm. A. baumannii biyofilm etkin GKL E101G / R230C / D266N mutant (A) ve GKL E101G / R230C mutant (B) ile muamele edilmiş ve Alexa ile boyandı Fluor WGA 488-konjüge. Biyofilm (solda) ve biyofilm (sağda) floresan görüntüleri DIC görüntüleri temsilcisi xy (merkez), yz (sağda) ve xz (alt) bölümler için gösterilmiştir. Antimikrobiyal Ajanlar ve Kemoterapi &lt;izniyle yayınlanmıştırstrong&gt; 58, 1802-1805 (2014). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53243/53243fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> SD a ± Değeri </td></tr><tr><td> Karakteristik </td><td> Hiçbir tedavi </td><td> Inaktif mutant ile tedavi </td><td> E101G / R230C mutant ile tedavi </td></tr><tr><td> Biyokütle (um 3 / mikron 2) </td><td> 2.57 ± 1.65 </td><td> 3.39 ± 1.33 </td><td> 1.37 ** 0.20 ± </td></tr><tr><td> Ort kalınlığı (um) </td><td> 3.68 ± 2.51 </td><td> 3.41 ± 1.31 </td><td> 1.21 ** 0.21 ± </td></tr><tr><td> Yüzey alanı (um) </td><td> 235,920.59 ± 79,456.46 </td><td> 209,872.6 ± 115,094.7 </td><td> 115,354.9 * ± 7,630.3 </td></tr><tr><td colspan="4"> Bir n = 10 resim yığınları. ** P ≤ 0,001; *, P ≤ 0,05 inaktif E101G / R230C / D266N mutant ile muamele ile karşılaştırıldığında. </td></tr></tbody></table> Tablo 1. A. baumannii biyofilm yapısal kantitasyon.

Watch this Scientific Journal Video about Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases at JoVE.com

Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases

Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.

Engineered Nisabı giderici Lactonases kullanarak Patojen Biyofilmler Anti-öldürücü bozulması

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The ...

anti-virulent-disruption-pathogenic-biofilms-using-engineered-quorum

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.6K Görüntüleme.  Yong Loo Lin School of Medicine. Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.

Video: Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtiter Bulaşık Biyofilm Oluşumu Testi

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Tek Sentetik Curli Operon Oluşturma tarafından Mühendislik Bağlanan Bakteriler

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Biyomühendislik

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Biyofilm İlişkili Hedefleme<em&gt; Staphylococcus aureus</emKullanma&gt; Resazurin Tabanlı İlaç-duyarlılık Deneyi

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of antibiotic-tolerant infections. Biofilms have displayed an exceptionally high tolerance for chemotherapy, which is thought to be multifactorial. For instance, the matrix provides a physical barrier that decreases the penetration of antibiotics into the biofilm. Also, cells within the biofilms are phenotypically diverse. Likely, biofilm resilience arises from a combination of these and other, yet unknown, mechanisms. All of the currently existing antibiotics have been developed against single-cells (planktonic) bacteria. Therefore, so far, a very limited repertoire of molecules exists that can selectively act on mature biofilms. This situation has driven a progressive paradigm shift in drug discovery, in which searching for anti-biofilms has been urged to occupy a more prominent place. An additional challenge is that there are a very limited number of standardized methods for biofilm research, especially those that can be used for large-throughput screening of chemical libraries. Here, an experimental anti-biofilm platform for chemical screening is presented. It uses three assays to measure biofilm viability (with resazurin staining), total biomass (with crystal violet staining), and biofilm matrix (using a wheat germ agglutinin, WGA-fluorescence-based staining of the poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG, fraction). All the assays were developed using Staphylococcus aureus as the model bacteria. Examples of how the platform can be used for primary screening as well as for functional characterization of identified anti-biofilm hits are presented. This experimental sequence further allows for the classification of the hits based upon the measured end-points. It also provides information on their mode of action, especially on long-term versus short-term chemotherapeutic effects. Thus, it is very advantageous for the quick identification of high-quality hit compounds that can serve as starting points for various biomedical applications.

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

Doğal Bileşik Kütüphaneleri Exploration uygundur Anti-biyofilm Tahliller Bir Platform

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

Yumuşak agar üst tabaka tekniği kullanımı bakteriyel olarak üretilmiş önleyici bileşiklerin taranması için

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural integrity. The nosocomial pathogen, Pseudomonas aeruginosa, is known to adopt a biofilm mode of growth, causing chronic pulmonary infection in patients with cystic fibrosis (CF). The computer program, COMSTAT, is a useful tool for quantifying antimicrobial-induced changes in P. aeruginosa biofilm architecture by extracting data from three-dimensional confocal images. However, standardized operation of the software is less commonly addressed, which is important for optimal reporting of biofilm behavior and cross-center comparison. Thus, the aim of this protocol is to provide a simple and reproducible framework for quantifying in vitro biofilm structures under varying antimicrobial conditions via COMSTAT. The technique is modeled using a CF P. aeruginosa isolate, grown in the form of biofilm replicates, and exposed to tobramycin and the anti-Psl monoclonal antibody, Psl0096. The step-by-step approach aims to reduce user ambiguity and minimize the chance of overlooking crucial image-processing steps. Specifically, the protocol emphasizes the elimination of subjective variations associated with the manual operation of COMSTAT, including image segmentation and the selection of appropriate quantitative analysis functions. Although this method requires users to spend additional time processing confocal images prior to running COMSTAT, it helps minimize misrepresented biofilm heterogenicity in automated outputs.

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Antimicrobial-induced changes to Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture differ among clinical isolates cultured from patients with cystic fibrosis and chronic pulmonary infection. Following confocal microscopy, COMSTAT software can be utilized to quantify variations in biofilm architecture (e.g., surface area, thickness, biomass) for individual isolates to assess the efficacy of anti-infective agents.

Antimikrobiyallerin İn vitro Biyofilm Mimarisi Üzerindeki Etkilerinin COMSTAT Yazılımı Kullanılarak Ölçülmesi

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural ...

Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are frequently used to cultivate bacterial biofilms for rapid antimicrobial susceptibility testing to calculate minimal biofilm eradication concentration (MBEC) values. Standard biofilm devices consist of polystyrene pegged-lids fitted to 96-well microplates and are ideal for measuring biofilm biomass and MBEC values, but these devices are limited by available peg surface area for biomass accumulation and cost. Here, we outline a protocol to use self-assembled polypropylene 96-well deep well PCR-plate pegged-lid device to grow Escherichia coli BW25113 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilms. A comparison of 24-hour biofilms formed on standard and deep well devices by each species using crystal violet biomass staining and MBEC determination assays are described. The larger surface area of deep well devices expectedly increased overall biofilm formation by both species 2-4-fold. P. aeruginosa formed significantly greater biomass/mm2 on deep well pegs as compared to the standard device. E. coli had greater biomass/mm2 on standard polystyrene devices as compared the deep well device. Biofilm eradication assays with disinfectants such as sodium hypochlorite (bleach) or benzalkonium chloride (BZK) showed that both compounds could eliminate E. coli and P. aeruginosa biofilms from both devices but at different MBEC values. BZK biofilm eradication resulted in variable E. coli MBEC values between devices, however, bleach demonstrated reproducible MBEC values for both species and devices. This study provides a high throughput deep well method for growing larger quantities of biofilms on polypropylene devices for downstream studies requiring higher amounts of static biofilm.

This protocol presents methodology to perform biofilm growth and biomass measurements using self-assembled deep well PCR-plate devices for high-throughput 96-well pegged lid static biofilm screening.

PCR-Plate Deep Well Microplate Cihazları Kullanılarak Daha Büyük Bakteriyel Biyofilm Biyokütlesinin Oluşturulması

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are ...

Evaluation of the Efficacy of Organic Peroxyacids for Eradicating Dairy Biofilms Using an Approach Combining Static and Dynamic Methods

The presence of biofilms in the dairy industry is of major concern, as they may lead to the production of unsafe and altered dairy products due to their high resistance to most clean-in-place (CIP) procedures frequently used in processing plants. Therefore, it is imperative to develop new biofilm control strategies for the dairy industry. This protocol is aimed at evaluating the efficacy of organic peroxyacids (peracetic, perpropionic, and perlactic acids and a commercial peracetic acid-based disinfectant) for eradicating dairy biofilms using a combination of static and dynamic methods. All the disinfectants were tested on the strongest biofilm-producing bacteria in either a single or a mixed biofilm using the minimum biofilm eradication concentration (MBEC) assay, a static high-throughput screening method. A contact time of 5 min with the disinfectants at the recommended concentrations successfully eradicated both the single and mixed biofilms. Studies are currently ongoing to confirm these observations using the Center for Disease Control (CDC) biofilm reactor, a dynamic method to mimic in situ conditions. This type of bioreactor enables the use of a stainless-steel surface, which constitutes most industrial equipment and surfaces. The preliminary results from the reactor appear to confirm the efficacy of organic peroxyacids against biofilms. The combined approach described in this study may be used to develop and test new biological or chemical formulations for controlling biofilms and eradicating microorganisms.

This protocol describes an approach combining static and dynamic methods to evaluate the efficacy of organic peroxyacids for eradicating biofilms in the dairy industry. This approach may also be used to test the effectiveness of new biological or chemical formulations for controlling biofilms.

Organik Peroksiasitlerin Süt Biyofilmlerinin Eradikasyonunda Etkinliğinin Statik ve Dinamik Yöntemleri Birleştiren Bir Yaklaşım Kullanılarak Değerlendirilmesi

The presence of biofilms in the dairy industry is of major concern, as they may lead to the production of unsafe and altered dairy products due to their ...

Biyoloji

<meta charset="utf8"></head><body>Çekirdek Algılama İnhibisyonunda Tiyofensülfonamidlerin Biyolojik Değerlendirmesi

Synthesis and Assay of Vibrio Quorum Sensing Inhibitors

Bacteria detect local population numbers using quorum sensing, a method of cell-cell communication broadly utilized to control bacterial behaviors. In Vibrio species, the master quorum sensing regulators LuxR/HapR control hundreds of quorum sensing genes, many of which influence virulence, metabolism, motility, and more. Thiophenesulfonamides are potent inhibitors of LuxR/HapR that bind the ligand pocket in these transcription factors and block downstream quorum sensing gene expression. This class of compounds served as the basis for the development of a set of simple, robust, and educational procedures for college students to assimilate their chemistry and biology skills using a CURE model: course-based undergraduate research experience. Optimized protocols are described that comprise three learning stages in an iterative and multi-disciplinary platform to engage students in a year-long CURE: (1) design and synthesize new small molecule inhibitors based on the thiophenesulfonamide core, (2) use structural modeling to predict binding affinity to the target, and (3) assay the compounds for efficacy in microbiological assays against specific Vibrio LuxR/HapR proteins. The described reporter assay performed in E. coli successfully predicts the efficacy of the compounds against target proteins in the native Vibrio species.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: İnsanlarda ve Sucul Organizmalarda Vibriosis'i Tedavi Etmek İçin Terapötiklerin Geliştirilmesi

Thiophenesulfonamide compounds are potent and specific inhibitors of Vibrio quorum sensing regulators LuxR/HapR that block their activity in vivo, thus preventing transcription of genes for virulence, motility, and biofilms. This protocol details how these compounds are synthesized, modeled in silico, and assayed in vivo for activity against LuxR/HapR.

Vibrio Quorum Algılama İnhibitörlerinin Sentezi ve Testi

Bacteria detect local population numbers using quorum sensing, a method of cell-cell communication broadly utilized to control bacterial behaviors. In ...

Engineered Nisabı giderici Lactonases kullanarak Patojen Biyofilmler Anti-öldürücü bozulması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler