Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.

1. Protein Numune Hazırlama ve Tampon <ol><li> Numune hazırlama: ilgi konusu proteinleri saflaştırmak ve bir jel filtrasyon kolonu üzerine ya da ultra-santrifüj ile deney öncesinde proteini enjekte edilerek, tüm gruplar kaldırılır emin olun (100,000 x g yeterlidir genellikle 10 dak). NOT: arzu edilen, yüksek ölçüde saf protein preparatları bir zorunluluk olmamakla birlikte,. SPR başarıyla az-daha-mükemmel arındırmalardan ve hatta toplam özü 8,9 ile kullanılmıştır. </li><li> Tampon hazırlama: <ol><li> (&quot;Tampon çalışan&quot; olarak adlandırılan, veya RB) deney tampon hazırlayın. Protokol, burada açıklandığı için, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl ve% 0.05 (ağırlık / hacim) DDM (n-Dodesil β-D-maltozit) kullanın. Tampon bileşiminin seçimi kolayca çalışılan sisteme göre modifiye edilebilir unutmayın. </li><li> 0.22 mikron filtreleri kullanarak tüm tamponları ve protein örnekleri Filtre. Filtreler protein olduğundan önceden emin olunUyumlu. Genel olarak, son zamanlarda pazara SPR platformlar bir in-line de-gasser ihtiva eder; Bu durumda, de-gaz değilse önce tamponlar kullanın. </li><li> Gecede Dialyze veya tampon uyuşmazlıklarını önlemek için RB karşı örnekleri sulandırmak. Yüksek viskozite kimyasal kullanıldığında Diyaliz (ya da tampon alışverişi başka bir yöntemle), özellikle tavsiye edilmektedir (örneğin, sükroz, gliserol, DMSO). Pompa girişine RB şişe bağlamadan önce ayrı bir tüp içinde bir kenara RB 10 ml tutmak. </li></ol></li><li> 20 ug / ml olan bir son konsantrasyona kadar RB içine konsantre bağ stokunu. Yüksek konsantrasyonlarda, yüksek akış ve kısa enjeksiyon aksine kural olarak, istikrarlı ligand Hareketsizleştirmesi için, düşük debide daha uzun enjeksiyonları ile düşük ligand konsantrasyonları kullanın. </li><li> Istenen konsantrasyona RB içine analit sulandırmak. Tipik haliyle, on misli seyreltmeler 10 nM ile 10 uM bilinmeyen afinite bir sistem için konsantrasyonlarının aralığı test edin. Her zaman başlayacakbirinci alt konsantrasyonlar mevcut olabilir. </li></ol> 2. Sensör Çip <ol><li> Çip seçme a nitrilotriasetik asit (NTA), bir oligo-histidin etiketi olan proteinleri tutulması için müsait bağlanmış çip kullanın. </li><li> Çip kullanımı: <ol><li> Yeni bir çip kullanırken, kılıfından çipi çıkarmak çift distile su (DDW) ile hafifçe yıkayın, hassas silecekler kullanılarak dikkatlice kalan sıvıları kapalı kuru ve altın tabakası yüzeyine dokunmamaya dikkat edin. (Çip düzgün yerleştirildiğinde ekleme pürüzsüz) doğru yönde geri kılıf içine çip yerleştirin. </li><li> Bir çip yeniden yaparken, tampon saklanan çip almak, yukarıda belirtildiği gibi yavaşça DDW ve kuru ile iyice durulayın ve orijinal kılıf içine yerleştirin. NOT: çip üzerinde spesifik olmayan önemsiz malzeme birikimi onun &#39;canlılığı&#39; etkileyebilir. Bu ligand hareketsizleştirme ve sonrası sıyırma önce RUs karşılaştırarak izlenebilir. Birçok ölçümler olabilir rağmenAynı Ninta çip kullanılarak yapılır, onun uzun ömürlü sorunu &#39;kesin&#39; değildir ve farklı yongaları arasında büyük ölçüde değişir. </li></ol></li><li> Çip yerleştirme: sensör çipi kapağını açın ve kılıf içinde çip yerleştirmek. Yeni bir çip kullanırken, giriş çipin seri numarası kullanım kaydını tutmak için. Kapı ve basın &#39;dok çip&#39; kapatın. </li></ol> 3. Sıcaklık Ayarları <ol><li> 25 ° C (ya da tercih deney sıcaklığı) çip hücre sıcaklığını ayarlayın. </li><li> İsteğe bağlı: deney boyunca sabit proteinleri tutmak için 7 ° C örnekleri bölme ayarlayın. </li></ol> Yükleme ve Sıyırma 4. Çözümler H2O RB (RB gibi nihai bir konsantrasyona kadar EDTA çözeltisi deterjan ekleme) RB 0.5 mM NiCl2, 350 mM EDTA,% 0.25 SDS ve H 100 mM HCI: yükleme ve sıyırma için aşağıdaki çözümleri hazırlanması 2 O. Mikro santrifüj küvet kullanıldığındaes ve belirlenen tüpler SPR, tüplerin kapaklarını kesmek unutmayın. 5. Başbakan SPR Enstrüman RB ile 6. Yeni Run Başlat <ol><li> Deney sırasında kullanılacak akış hızını ayarlayın. Burada anlatılan sonuçları elde etmek için 50 ul / dk akış ayarlayın. NOT: Bu parametre deney sırasında değiştirilebilir. </li><li> Akış yolları ve referans çıkarma tanımlayın. Burada açıklanan yolları Fc = 1 ve Fc = 2, çıkarma Fc = 2-1 set sonuçlar elde etmek için. NOT: Program gerçek zamanlı olarak ölçülen iki hücre çıkarma gösterecektir. Bu parametre deney sırasında değiştirilemez unutmayın. </li><li> Uygun numune raf seçin (örnek hacmi tüketimini etkileyebilir). </li><li> Sonuçlar dosyayı kaydedin. </li></ol> 7. Deney döngüleri Her deney döngüleri oluşur, ea yapılan enjeksiyonlar net bir kaydını tutmakch döngüsü ve ligandlar &#39;yükleme, tamponunun boş enjeksiyon, ve farklı döngüleri içine analit enjeksiyonu ayrı. <ol><li> Döngü 1: Chip hazırlama ve nikel yükleme <ol><li> 6.1 ve 6.2 adıma göre akış ve yolları ayarlanmış olduğundan emin olun. </li><li> 1 dk kalanlar yıkayacak için 350 mM EDTA enjekte. </li><li> 10 ul / dk akış ayarlayın. </li><li> 2 dakika boyunca 0.5 mM NiCl2 enjekte edilir. NOT: Şimdi çip reçine nikel iyonlarının tarafından kaplanır. </li></ol></li><li> Döngü 2: immobilizasyonunu ligandlar <ol><li> 15 ul / dk, akış yolu Fc = 2 Set akışı. </li><li> Moleküler ağırlığının 10-20 misli olan RU değerleri elde edilene kadar bir ligand enjekte edilir. Örneğin, RU 500-1,000 kadar 50 kDa&#39;lık bir ligand yükleyin. Elde RU değer bir kaydını tutun. </li><li> 15 ul / dk, akış yolu Fc = 1 Set akışı. </li><li> Ligand A. bu kontrol yardımcı on-line çıkarma sensogram (Fc = 2-1) Monitör aynı RU değerine kadar ligand B (kontrol) enjekteEnjeksiyon uzunluğu. </li><li> 50 ul / dk, akış yolu Fc = 1 ve Fc = 2 Set akışı, başlangıçta kadar 5-20 dakika yıkayın sistemi (Fc = 2-1) stabilize. </li></ol></li><li> Döngü 3: Boş enjeksiyonu. Bu enjeksiyon, bu nedenle analitin kendi dışında bir analit ile birlikte enjekte edilecek olan tüm bileşenleri içeren boş çıkarma hizmet edecektir. NOT: Enjeksiyon uzunluğu denge (sinyal yaylalar) ulaşmak için gereken süre bağlı olarak değişebilir. <ol><li> 15 ul / dk, akış yolu Fc = 1 ve Fc = 2, Fc = 2-1 çıkarma Set akışı. </li><li> 30 saniye (&#39;bekle&#39; olarak bundan sonra anılacaktır) &#39;bekle&#39; komutunu yerleştirin (istikrarlı bir temel sağlamak için). </li><li> 15 sn RB enjekte. Not: enjeksiyon süresi öncesi denge kinetik sabitler (çoğunlukla k) bağlı olarak, farklı sistemleri arasında değişir. </li><li> Ayrışma safhasının kaydetmek için 120-600 saniye. NOT: Bu adım uzunluğu göre değişir <em&gt; k d: ayrışma artık bu adımı olmalıdır yavaş. Çok yavaş ayrıştıracak kompleksleri (k d &lt;10 -4 sn -1) için, 10-15 dakika bekleyin ve sonra (daha sonra bakın) rejenerasyon yüzey geçin. </li></ol></li><li> Döngü 4: analit enjeksiyon <ol><li> Kopya / referans enjeksiyonu (döngüsü 3) bu yüzden bu iki enjeksiyonları sonra çıkartılabilir kullanılan tam koşullar yapıştırın. Analit çözümü tutan bir kontrol çözümü tutan birinden rafa yuvanın yerini değiştirin. Beklenen K D biraz üzerinde bir konsantrasyon seçin. Hiçbir ön bilgi varsa, iyi bir başlangıç ​​noktası olarak 1 mcM seçin. </li></ol></li><li> Döngü 5: Tampon enjeksiyon <ol><li> Tekrar döngüsü 3. </li></ol></li><li> Döngü 6: analit enjeksiyon <ol><li> Tekrar döngüsü 4. </li></ol></li><li> Döngü 7: Chip kapalı şerit <ol><li> 50 ul / dk akış ayarlayın. &lt;/ Li&gt; <li> 1 dakika için 350 mM EDTA enjekte edilir. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Bu çip zarar verebilir 3 dakika tek bir enjeksiyon kullanmayın. </li><li> 1 dakika boyunca% 0.25 SDS enjekte edilir. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Bu çip zarar verebilir 3 dakika tek bir enjeksiyon kullanmayın. </li><li> Taban çizgisi seviyesi ulaşılamaması halinde, ilave sıyırma aşaması olarak 1 dakika için 100 mM HCI enjekte edilir. </li><li> Bekleme moduna geçer &#39;uç koşmak&#39; komutunu yerleştirin. </li></ol></li><li> Çip depolama <ol><li> Sensör çip çıkarın ve cihazın dışarı almak. </li><li> Kendi kılıfından sensörü çıkartın yüzeyine dokunmaktan kaçının, DDW ile durulayın ve RB içeren 50 ml&#39;lik bir tüp içinde yer. 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li></ol> 8. Veri Analizi Değerlendirme Yazılımı Belirlenmiş kullanma <ol><li> Kinetik parametrelerin türetme önce SPR tarafından elde edilen ham verilerin işlenmesi için aşağıdaki adımları uygulayın. <ol><li> Değerlendirme yazılımını kullanarak, açıksonuç dosyası seçin döngüleri 3-6 Fc = 2-1 (referans verilerini çıkarılır). </li><li> Eksen kayması: <ol><li> Ekran döngüleri 3-6. </li><li> Sıfır dört eğriler için taban (her döngüsünde ilk 30 sn bekleme süresi) Y-ekseni değeri. </li></ol></li><li> Dört Eğrilerin X eksenini hizalayın. Belirgin özellikleri seçin (örneğin, enjeksiyon başlangıç ​​veya bitiş zamanları) mükemmel X-ekseni boyunca dört eğrileri hizalamak için. Sıfıra analit (veya kontrol tamponu) başladığı zamanı ayarlayın. </li></ol></li><li> Referans çıkarma <ol><li> Kullan Y-ekseninde bulunabilir eğri çıkarma işlemi menüsünü kaydırır döngüsü 6. eğriden döngüsü 4 ve döngüsü 5 eğrisinin gelen döngüsü 3 eğrisini çıkarılarak arka plan yanıtı çıkartın. NOT: Bu yüzey kırılma indeksi etkilemiş olabilir (analit ilgisiz) herhangi bir spesifik olmayan bileşenleri iptal etti bu adımı gerçekleştirmek için önemlidir. <ol><li> T çıkarılır eğrileri kaydetO farklı bir isim altında projenin sac. </li></ol></li><li> &quot;Çifte çıkarılır eğriler&quot; olarak bu eğrilerin bakın: İlk çıkarma hem enjeksiyonlar gerçekleştirilir 2-1 çıkarma ve ikinci diğerinden eğrinin çıkarma olduğunu. NOT: Bu tür çift referans SPR deneyler altın standarttır. </li><li> Daha önce açıklandığı gibi eksen kayması gerçekleştirerek çıkarılır eğrileri Yerleşimi. </li></ol></li><li> Kinetik sabitler ve model montaj belirlenmesi <ol><li> Bir kinetik deney yapılması <ol><li> Kinetik sabitlerin belirlenmesi için güvenilir bir veri için 6-7 analit konsantrasyonları bir dizi enjekte edilir. Dan analit konsantrasyonunu seçin 2-3 kat seyreltilerde, tahmin K D altında 10 kat yukarıda 10 kat. Daha sonra (yukarıya bakınız) çift referans çıkarma için kullanılan &quot;sıfır&quot; konsantrasyonu, ekleyin. Üçlü ve rastgele sırayla enjeksiyonları Davranış. </li><li> Hizalamave model uydurma denemeden önce Y-ekseni ve X-eksenine göre tüm eğrileri çıkarma. </li></ol></li><li> Model uydurma <ol><li> Uygun analiz programı seçin. NOT: Çoğu mevcut montaj programları uydurma ve kinetik sabitleri tayini için uygulanabilir çeşitli modeller sunuyoruz. </li><li> Analit ve montaj için ligand arasındaki etkileşimi 1: geri dönüşümlü bir 1 varsayarak basit modeli (Langmuir) uygulayın. Veri ikna daha karmaşık bir etkileşim varlığı için diğer deneysel yöntemler kullanılabilir sürece, her zaman basit, Langmuir modeli kullanın. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+surface+plasmon+resonance+biosensor+analysis.">Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. H. i. g. h. e. r. -. t. h. r. o. u. g. h. p. u. t. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).</li><li>Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+label-free+bio-sensing+of+molecular+interactions+by+surface+plasmon+resonance:+a+laboratory+medicine+perspective.">Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective.</a> The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).</li><li>Kyo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+MafG+interaction+with+Maf+recognition+element+arrays+by+surface+plasmon+resonance+imaging+technique.">Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique.</a> Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).</li><li>Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+studies+of+RNA&#8211;protein+interactions+using+surface+plasmon+resonance.">Kinetic studies of RNA&#8211;protein interactions using surface plasmon resonance.</a> Methods. 26, 95-104 (2002).</li><li>Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+molybdate/tungstate+ABC+transporters+that+interact+very+differently+with+their+substrate+binding+proteins.">Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).</li><li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation.">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li><li>Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Detection+of+Proteins+in+Crude+Cell+Lysate+with+Antibody+Arrays+by+a+Surface+Plasmon+Resonance+Imaging+Technique.">Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique.</a> Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).</li><li>Mori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+protein+kinase+activities+of+cell+lysates+using+peptide+microarrays+based+on+surface+plasmon+resonance+imaging.">Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging.</a> Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).</li><li>Mol, N., Fischer, M. E., Mol, N. J., Fischer, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. 1, 1-14 (2010).</li><li>Van Der Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Surface plasmon resonance. Protein&#8211; ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , 137-170 (2001).</li><li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation.">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li></ol>

All authors declare that they have no competing financial interests.

SPR moleküler etkileşimleri incelemek için son derece hassas bir yöntemdir ve geçici (henüz önemli) etkileşimlerin gerçek zamanlı izleme sağlar tek yaklaşım genellikle. Bir örnek başka bir yöntemle (açılan deneyleri, lipozomlar sedimantasyon tahlilleri 6) tarafından tespit edilememiştir burada sunulan geçici etkileşim vardır. Diğer yöntemler (nicel veya nitel olsun) ölçümleri denge sınırlıdır Dahası, SPR da ön denge kinetiği ölçmek tek tekniklerden biridir. Onun artan duyarlılık aynı zamanda ihtar olduğunu. Yanlış pozitif öz sensogramlar kolayca kaydedilir. Bu nedenle, SPR ölçümleri başlamadan önce başka yöntemler kullanılarak etkileşim varlığını oluşturulması önerilir. (Geçici etkileşim vs istikrarlı K D kaba değerlendirme) sistemin özellikleri ön bilgi SPR experime kurma çok yararlıNTS ve elde edilen ölçümlerin fonksiyonel alaka değerlendirmek. SPR ölçümleri başlangıç ​​protein örneklerinin kalitesi önce önemli bir konu akılda tutmak. SPR agrega son derece duyarlı olup, bu ligand ve (jel filtrasyon kromatografisi veya ultra-santrifüj mümkün göre) analit preparatlar hem de çıkarılması gerekir. Gürültü ve yanlış sinyallerin başka kaynak RB ve analitin tampon arasındaki tampon uyumsuzlukları kaynaklanıyor olabilir. Bu, RB karşı analit diyaliz veya RB içine birçok kıvrımlar sulandırılır analit (~ 100-1,000 kat) bir derece konsantre hazırlık kullanılarak çözülebilir. Yanlış pozitif veriler çipin matris ile veya negatif kontrol analitin spesifik olmayan etkileşimleri sonucu olabilir. Bu etkileşimler bazen düşük analit konsantrasyonları kullanılarak önlenebilir düşük afinite bulunmaktadır. Buna ek olarak, düşük BSA ve / veya deterjan konsantrasyonları (0.1 mg / ml ve / veya 0,05 dahil), Sırasıyla (a / h) RB ve enjekte analit örnek% 0.1 spesifik olmayan etkileşimleri azaltabilir. Negatif kontrol hücresi (farklı negatif kontrol) içeriği değiştirme spesifik olmayan bağlanma sorunları ile başa çıkmak için başka bir yaklaşımdır. Alternatif olarak, yonga başka türünü kullanarak da veri kalitesini etkileyebilir. Sensör çipinin Çeşitli farklı kimyalar göre, ticari olarak temin edilebilir. En sık kullanılan sensör çipine (CM-5 çip) karboksimetile dekstran kovalent bir altın yüzeye bağlanır. Proteinler kovalent çok basit bir yüzey kimyası, çeşitli (en yaygın olarak bir amin veya tiyol birleştirme) ile sensor yüzeyi ile birleştirilebilir. Membran proteinleri kovalent immobilizasyon ile çalışırken Ancak, bizim ellerde, genellikle eserler verir ve böylece seçilecek yöntem değildir. Bir zar proteini okuyan bağlamında, lipofilik moleküller ile kaplanır, ticari fiş olduğu dikkat çekicidir. Bu IMMOB etkinleştirmekBir yerli-benzeri bir ortamda üzerine membran proteinlerinin yonu. Benzer sensör yongaları da &#39;evde&#39; hazırlanabilir. Diğer bağlantı yöntemlerinin açıklaması için 10,11 bakın. Burada tarif edilen protokol, His etiketli, deterjan içerisinde çözünebilen taşıyıcı hareketsizleştirilmesi için Ni-NTA yonganın kullanımına dayanmaktadır (analit yonga yüzeyi bağlanma analiti bilmek His ile etiketlenmiş değildir). Bizim deneyim 6,12 Ni-NTA çipleri ile yapılan deneylerde elde edilen kinetik sabitler anadili gibi ortamlarda tespit edilenlerle iyi bir uyum içindedir. Ni-NTA yongaları nispeten pahalı olmasına rağmen, birincil avantajı, ligandın sıyrılmış ve yeniden kullanılabilir olmasıdır. Ölçümlerin yüzlerce çip başına yapılabilir. Ayrıca, çip üzerindeki ligant oryantasyon his-etiketi konumu tarafından belirlenir ve bu nedenle oldukça homojendir. Bir etkileşim başarıyla SPR, kontrol ve REPE bir dizi kaydedildiğindeats SPR sinyali geçerliliğini doğrulamak için gereklidir. Aşağıdaki parametrelerin Doğrulama SRP verileri doğrulamak için yardımcı olabilir: SPR sinyalindeki 1. Özelliği: SPR hassasiyeti nedeniyle, uygun negatif kontrollerin kullanımı özel önem taşımaktadır. SRP tarafından kaydedilen Spesifik olmayan etkileşim matrisine bir analitin adsorpsiyonuna bağlı olabilir. Protein (ligant) ile yüklü bir akış hücresi kimyasal bir boş akış hücresinden eşdeğer olmadığı Bu nedenle, bir boş akış hücresi, genellikle en iyi seçenek değildir. Daha iyi bir seçenek ligandın bir inaktif mutan varyantı analiti bağlamak için bilinen bir kullanmaktır. Seçenek olarak ise, bir benzer mutasyona uğramış analiti kullanabilir. Bu tür mutantlar mevcut değilse, bir homolog protein (ama farklı bağlama spesifikliği) 12 kullanılabilir. İyi Negatif kontrol örnekleri, (burada açıklandığı gibi), bir homolog ligandı, ya da bilinen etkileşim ortaklarından biri bir nokta mutasyonudernek ortadan kaldırmak. Başka bir negatif kontrol etkileşim için gerekli olan bir post-translasyonel modifikasyon (örneğin, fosforilasyon, metilasyon, tiol türev) bir değişiklik olduğunu önermiştir. Örneğin, SH2 etki etkileşimi için elzem olan bir tirozin de-fosforilasyonu. Diğer negatif kontroller sistemine özgü olabilir. SPR kullanırken, sıkı olumsuz denetimleri kullanarak önemi göz ardı edilemez. SPR sinyali 2. tekrarlanabilirliği: SPR son derece tekrarlanabilir bir yöntemdir. Eşit ligand miktarları biyosensör çipi üzerine yüklenir ve analitin eşit konsantrasyonları tekrarlar mükemmel hizada olmalıdır enjekte edildiğinde (Şekil 3). Sistemin 3. rejenerasyonu: la fonksiyonel ve yapısal bütünlüğünü korurken, yavaş bir ayrışma hızı (Kd) ile etkileşim içinde, analit, liganddan sıyrıldı olmalıdırtter. Ayrışma ve / veya yenilenmesi eksik ise, SPR sinyali yavaş yavaş analitin sonraki enjeksiyonlar üzerine çürümeye olacaktır. Test edilebilir tipik yenileyici koşulları Mg yüksek konsantrasyonlarda 2 + (2 M kadar), asidik ya da bazik şartlar (örneğin, 10 mM glisin, pH 2.5, 10 mM NaOH), tuz (en fazla 4 M NaCI), ya da vardır yüksek deterjan konsantrasyonu (örneğin,% 1 DDM). Ancak, bu reaktif (ve diğerleri) rejenere etkinliği yüksek sistem özel ve böylece Rejenerasyonlarını koşulları test edilmelidir olduğunu. Bazı durumlarda, etkileşim yenilenmesi E. durumunda olduğu gibi hiçbir zaman tam bir şekilde, kararlı ve kuvvetli coli B 12 vitamini taşıma sistemi (BtuCD-F) 7. Bu koşullar altında, tek seçenek biyosensör çip ligand şerit ve her enjeksiyon için yeni bir toplu yeniden etmektir. Ligand Analitin ayrışma durumlarda hızlı ve eksiksiz yüzey yenilenmesi gereksiz(Protokolü görmek ve 2-3 Şekil). 4. Zar proteinleri, her zaman SPR duyarlılık ve reaksiyon hızlarını etkileyebilen deterjanın varlığında, arıtılmaktadır. Ancak, BtuCD ile bizim deneyim, ölçülen oranlar çok benzer. Bir her zaman böyle boyut dışlama kromatografisi gibi ücretsiz yaklaşımlar (SEC) kullanarak destekleyici kanıt elde etmek gerekiyor, SPR ve diğer teknikler arasında bir korelasyon metiyonin için gösterilmiştir Örneğin açılan deneyleri, lipozom sedimantasyon tayini, vb, vitamin B 12, ve iki molibdat sistem 6,12. Kinetik hız sabitlerinin belirlenmesi Hatalı genellikle uydurma sürecinde ortaya çıkar. Analiz kinetik deneyler için 1 etkileşim modeli: bir kural olarak, her zaman basit Langmuir 1 geçerlidir. daha karmaşık modeller yapısal değişiklikler, iki değerlikli analit, veya örnek heterojenite ek varsayımlar yapmak. Bu varsayımlar olmalıdırdiğer deneysel yaklaşımlardan kanıtlarla desteklenen yalnızca yaptı. Bu modelleri uygulayarak daha iyi montaj ve düşük Ki 2 değerleri en muhtemel sonuç, ama bu onların güvenilirliği için bir tanıklık olarak görülmemelidir unutmayın. daha karmaşık modeller sağladığı özgürlük yüksek derece ziyade onların mekanik alaka daha genellikle iyi uydurma sorumludur. SPR avantajlarından biri de, özellikle çözündürülmesi ve zar proteinlerini saflaştırmak için kullanılan deterjan ile ilgili olarak, geniş bir kimyasal uyum sağlamasıdır. Bununla birlikte, çoğu zaman zar proteinlerinin saflaştırılması işlemi esnasında ilave edilir sükroz ve gliserol (ve diğer viskoz çözeltiler) RU üzerinde dramatik etkileri vardır. Bu nedenle, eğer mümkünse, bu önlemek ya da en azından bunların konsantrasyonunun düşürülmesi tavsiye edilir. Viskoz çözümleri kullanırken, tampon uyuşmazlığı kaçınarak gerekli olur. RB içeren bir deterjan lipidler ekleme bağlama işareti büyütebilirolduğu kadar, on kat tarafından diğ. Bununla birlikte, böyle bir girişim (çoğu lipidler için) pahalı ve biyosensör yongaları ömrünü kısaltır eğilimindedir. Yeni bir sistem kalibre ederken yukarıda listelenen ipuçları ve sorun giderme yardımcı olabilir. Ancak, herhangi bir sistem, genellikle en iyi sonucu elde etmek için (örneğin, deterjan, tuz, pH seçimi) belirli bir ince ayar gerektirir. SPR uzun moleküler etkileşimleri ölçmek için güçlü ve benzersiz bir yaklaşım olarak kabul edilmiştir. Son yıllarda çeşitli SPR platformlarda ve onların fiyatlarındaki düşüşlerin kullanılabilirliği SPR daha yaklaşılabilir yaptı. Hızla ve kurşun küçük molekül inhibitörleri keşfetmek protein-protein etkileşimleri, hedef protein-ilaç etkileşimleri incelemek için altın standart yaklaşım haline geliyor.

Protein-protein etkileşimleri (ÜFE); oluşumu ve protein kompleksleri ayrışma, birçok biyolojik süreçler (örneğin, replikasyon, transkripsiyon, çeviri, sinyal, hücre-hücre iletişim) anahtar olaylardır. ÜFE Yarı kantitatif çalışmalar genellikle çekme-aşağı veya immün-yağış deneyleri kullanılarak yapılmaktadır. Bununla birlikte, bu (ve benzeri) teknikleri nedeniyle bu tür teknikler doğasında olan yıkama adımları için ölçülebilir afinite aralığında (düşük mikromolar ve daha yüksek afinite) sınırlıdır. Bu tür &quot;son nokta&quot; teknikleri genellikle büyük biyolojik sonuçları vardır geçici veya düşük afinite etkileşimleri tespit edemez. Buna ek olarak, bu yaklaşımların zamansal çözünürlüğü derece, reaksiyon oranlarının daha yavaş büyüklük genellikle sipariş sınırlıdır. SPR nedeniyle artan hassasiyet ve üst temporal çözünürlük 1,2 bu eksikliklerin üstesinden gelir. SPR gibi ve bir etiket içermeyen bir yöntemdir(kütle değişiklikleri tespit edilebilir olduğu sürece) moleküler etkileşim ölçülebilir. PPI ek olarak, geniş bir protein-ligand ve protein-ilaç (veya küçük molekülü) ve protein-DNA ve protein-RNA etkileşimi 3-5 karakterize etmek için kullanılmaktadır. Sonuçlar kaydedildi ve deneysel koşullar ve esnek deneysel tasarım hızlı değiştirilmesini sağlar gerçek zamanlı, çizilir. SPR temelli araçların arkasında fiziksel prensibi kütle 2 değiştirir üzerine sensör yüzeyinde kırılma endeksi bir değişiklik ölçen bir optik sistemin kullanılmasıdır. Etkileşim ortakları (bundan sonra ligand) biri polimer matris çip ve ikinci molekülün (bundan sonra analit) yüzey üzerinde aktı üzerine immobilize edilir. Analit, liganda çip yüzeyi üzerinde kitle değiştirir. Bu kütle değişim, doğrudan ve oransal yüzeyin kırılma indeksi değişikliklerle ilgilidir. Sonuçlar, gerçek zamanlı olarak çizilir vezamanın bir fonksiyonu olarak cevap birimleri (RU) olarak sunulmuştur. Böyle bir komplo, bir sensogram olarak adlandırılır (örneğin, Şekil 1). SPR etkileşimi tamamen zaman sürecini takip ettiğinden ön denge kinetik hız sabitleri afinitelere denge ek olarak elde edilir. Aşağıda ayrıntılı olarak, belirli bir sistemin ön denge davranışı çok bilgi tutar ve yalnız denge çok farklı bir bakış açısı sağlar. Sistem kalibre sonra, deneyler çok hızlı ve (tutarlar nanogram için mikrogram) protein malzemesinin sadece küçük miktarlarda gerektirir. Verilen bir sistemin kinetik bilgi toplanması gün içinde elde edilebilir. SPR yüksek hassasiyet başka bir teknik kullanılarak 6 mümkün değildir ölçümleri tanıyor. Ancak, bu yüksek hassasiyet yanlış pozitif veriler için önemli bir kaynak olabilir çünkü bir &#39;iki ucu keskin bir kılıç &quot;dir. Yansıtıcı endeksi etkileyen herhangi bir faktör kaydedildi ve sensogram üzerine çizilir. Örneğin, ap Adıpropriate kontrolleri yanlış pozitif ortadan kaldırmak için kullanılması gerekir, ve tamamlayıcı yaklaşımlar destek son derece tavsiye edilir. Şekil 1, bir NTA-kaplı sensör çipi kullanan bir SPR deney ilerlemesini göstermektedir. Panel A sensogram NTA matris üzerinden nikel iyonlarının (çıkartılmamış veri) enjeksiyonu gösterir ve paneller BD negatif kontrol hücresinden elde edilen sinyal çıkarıldıktan sonra verileri görüntüler. Kırmızı ve mavi oklar sırasıyla, enjeksiyon başlangıç ​​ve bitiş göstermektedir. Enjeksiyon sona kadar çip üzerine ligand İmmobilizasyonu yavaş yavaş kitle değiştirir. ligandın enjeksiyon sona ermesinden sonra gözlenen istikrarlı plato yüzeyi (Şekil 1B, çevrim 2) ligand istikrarlı bir ilişki yansıtır. Istikrarlı bir temel elde edildikten sonra bir tampon ligand ve .Bu enjeksiyon bir &#39;boş kontrolü &quot;olarak hizmet vermektedir referans hücresi (döngüsü 3 Şekil 1B) üzerine enjekte edilir, ve olacaktırAnaliz sırasında çıkarılır. Enjeksiyon üzerine, küçük değişiklikler çip sayesinde kitle akışını yansıtan, kaydedilir. Daha sonra, ayrı bir döngü (Şekil 1B, program 4) içinde, analit, enjekte edilir; RU kademeli artış bağına Analitin dernek temsil eder. dengeye ulaşana kadar, bağlanma yerleri yavaş yavaş işgal hale gelir. En kısa sürede enjeksiyon biter gibi, RUs bir düşüş Kompleksin ayrışma yansıtır. Ön denge ve denge hız sabitleri elde edilebilir tür öz sensogramlar itibaren. (Daha sonra bakın) 1 ligand ve analit arasındaki geçici etkileşim tasvir Şekil. Etkileşim daha stabil olduğunda, RU düzeyinde düşüş daha düşük bir k d yansıtan, yavaştır. Bu yazıda, aynı kökten gelen substrat proteini 6,7 bağlayıcı bir membran taşıyıcısı (deterjan çözülebilir) ve fonksiyonel ortağı arasındaki etkileşimi karakterize amaçlayan bir SPR deney tarif. seçilen model sistem, bir ATP bağlama kaseti (ABC), taşıyıcı, Archeaglobus fulgidus arasında ModBC-A&#39;dır. Bu sistem oranları &#39;on / off&#39;, onun yüksek tekrarlanabilir sonuçlar için gürültü oranı yüksek sinyal seçilir ve klasik oldu. Ayrıca, homologları ABC taşıyıcıları olarak önemli negatif kontroller hizmet etmek vardır. taşıyıcı, ModBC (ligant A) deterjan saflaştırılmış ve çip üzerinde hareketsiz kılınmış kullanılarak membran elde edilir. Onun çözünebilir etkileşim ortağı, Moda, analit olduğunu. Negatif kontrol ligand olarak, farklı bir ABC transportör RbsBC (&quot;bağ B&quot;) kullanılır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="601">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biacore T200</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9750-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sensor Chip NTA&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">14100532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">BIAevaluation</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Biacore T200 Software&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Nickel chloride</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium tungstate dihydrate</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T2629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Lab LTD.</td>
			<td style="width:119px;">19030591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Trizma base</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:209px;">Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:209px;">n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:107px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Sodium dodecyl sulfate solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Kimwipes KIMTECH</td>
			<td style="width:107px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:107px;">GADOT</td>
			<td style="width:119px;">7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon (NY) Membrane Filter</td>
			<td style="width:107px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">25007--47------N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">ModBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">RbsBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">ModA Substrate Binding Protein</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time measurements of membrane protein:receptor interactions using surface plasmon resonance (spr)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Burada tarif edilen bir sistemde, Ninta çip His ile etiketlenmiş zar taşıyıcı 6,7 hareketsiz hale getirmek için kullanılır. Bir homo-dimer olmak, her taşıyıcı iki kat onun Ninta çip bağlanması iyileştirilmesi, etiketlenir. Nikel yükleme, ligand A (faiz taşıyıcı) ardından RU 3,500 ~ kadar, Fc = 2 üzerine immobilize edilir (protokol döngüsü 2, Şekil 2A siyah etiket). Ardından, aynı akışı ve enjeksiyon süresi, ligand B (kontrol ligandı) kullanarak başlangıçta sadece kadar ~ 3.000 RU ulaşan, Fc = 1 üzerine enjekte edilir. Içindeki protein miktarlarının her iki akış hücreleri üzerinde hareketsiz olduğundan emin olmak için; Ligand B daha dikkatli 3.500 RUs için yükleme kadar izlerken, kısa enjeksiyon kullanılarak, yüklenir. &#39;Merdivenlerde&#39; şekil her enjeksiyon (Şekil 2A gri etiket) üzerine Fc = 1 kitle kademeli artışı ifade etmektedir. Fc bir on-line izleme = 2-1 eşit ligand yükleme kontrol yardımcı olur. Şekil 2B Fc = 2- gösteriyor1 çıkarma, yani, Fc = 1 RU değer adım adım artışlarla gelen Fc = 2 maksimum RU değeri, çıkarılmasıyla. Bu incelenmiş ve kontrol ligandların eşit bir yük elde etmek için ligandlar &quot;enjeksiyon süresini değiştirmek için önemlidir. Analiti enjekte Bunun tersine, enjeksiyon süresi kullanılan bütün konsantrasyonlarda sabit tutulmalıdır. Şekil 3A ve 3B, bir &quot;boş analiti &#39;enjekte edilmesi ile ölçülen yanıtlar gösterdiğini belirtmiştik (yani, RB sadece analiti çıkarılır) döngüsü 3 ve 5, ve, analit, enjeksiyonlar (döngüsü 4 ve 6). Her iki öz sensogramlar Fc = 2-1 çıkarma temsil ettiğini unutmayın. Döngüleri (3-6) (boşluk veya belirli bir konsantrasyon) özdeş bir analit enjeksiyon her iki akış hücreleri üzerine uygulanır Farklı ligandlar ile hareketsiz kılınmış. İki tekrarlar SPR yüksek tekrarlanabilirlik gösteren, çok iyi üst üste. Bir yanıt her iki durumda da kaydedilir; ~ 3 karşı boş RU ~ 4Analit için 0 RU. Bu değerler, ~ 13 gürültü oranına bir sinyal gösterir. Sadece spesifik bağlanma yanıtı temsil çift referans öz sensogramlar, elde edilmesi için, boş enjeksiyon hemen analit enjeksiyon (~ 37 RU, Şekil 3C) çıkartılmaktadır. Kaydedilen sensogram geçici etkileşim paternlerini göstermektedir. Enjeksiyon sırasında, bağlanma fazı yaklaşık 7 saniye sonra sabit duruma ulaşıldıktan, ligand-bağlı reseptör analit miktarında hızlı bir artış ile karakterize edilmektedir. kararlı durum sürece analit enjekte olarak muhafaza edilir. Enjeksiyon sonlandığında, hücreler RB ayrılma fazı tetikleme ile yıkanır. Karmaşık hızla ayrışarak, ve analit gibi uzak ligandından başlangıca SPR sinyali döner yıkanır. Nicel verileri (ön-denge ve denge sabitleri) kazanmak için, analit konsantrasyonlarının bir dizi çiftleri veya üçlü (protokolünde 8.3.1 bakınız) enjekte edilir. <stRong&gt; Şekil 4 sabit enjeksiyon uzunluğu tutarak farklı analit konsantrasyonlarında (her bir konsantrasyon başına çiftleri), enjeksiyonları gösterir. Farklı analit konsantrasyonu rastgele bir sırayla enjekte edilir ve çift kesilmesinin öz sensogramlar X ekseni analiz öncesi hizalanmış. Afinite ve hız sabitleri elde etmek için bir model uydurma (protokol bölümünde 8.3.2.2 bakın) uygulanır. Şekil 4&#39;te gösterilen ModBC-bir etkileşim için hesaplanan Denge ayrılma sabiti (KD) &#39;dir ~ 3 x 10 -6 M, bir orta hızlı bir (bir (~ 10 4 M-1 sn-1) ve hızlı bir Kd ile 0.1 sn-1). <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/51937/51937fig1highres.jpg" /> Bir Ni-NTA sensör çipini kullanan bir SPR deney aşamalarının Şekil 1. Çizim. (A </(gösterilen akış hücreleri Fc = 1 ve Fc = 2 NTA matris üzerinden nikel strong&gt;) Enjeksiyon) çıkartılmamış eğrileri vardır. kütlesindeki artış düşüktür (~ 30-50 RUs). (B - D) bir SPR deney sırasında kaydedilen Fc = 2-1 sensogram çizimi. His-etiketli ligand olarak çevrim 2, Ni yüklü bir yüzey üzerine enjekte edilir kütlesi tedrici birikir. (Ligandın MW bağlı) 1000-5000 RU arasında değişen bir nihai RU değeri ulaşıldığında Enjeksiyon sonlandırılır. Bir taban çizgisi çip ligandın kararlı bağlanma yansıtan oluşturulur. Döngüsü 3, boş enjeksiyon, analit dışındaki analiti numune bileşenleri enjekte öncede oluşturulur. Bu enjeksiyon sıklıkla düşük tepki (1-5 RUs) kaydedilir. Döngü 4&#39;te analit boş enjeksiyonla aynı rejimi kullanılarak enjekte edilir. artan RUs yüzeyi, yani, ligand analtik bağlanma kütle değişimi yansıtmaktadır. Sinyal hızla inci gibi daha sonra yaylaları artırır vee sistemi dengeye ulaşır. Enjeksiyon sonlandığında, analit sinyalinde bir azalmaya yol açan, bağ ayrıdır ve başlangıç ​​seviyelerine geri döner. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/51937/51937fig2highres.jpg" /> Ligand yüklemelerinde hattı izlenmesi Şekil 2. (A). Ligandı yükleme çıkartılmamış eğrileri. Çevrede (ligand &quot;A&quot;) ligand istenen RU seviyesine (~ bu örnekte 3500 RU) ulaşana kadar hücre 2 (Fc = 2, siyah) akmasına yüklenir. Daha sonra, negatif kontrol ligandı (Ligand &quot;B&quot;) adım adım yüklenmiş aynı RU seviyesine kadar akış hücresi 1 (Fc = 1, gri) üzerine yakalanır. Bir Fc = 2-1 çıkarma gibi, gerçek zamanlı olarak izlenir (B), (A) &#39;da yapılan iki enjeksiyonu yapıldı. Bu izleme ilgi ve kontrol ligandların aynı yüklemeyi kolaylaştırır. <img alt= &quot;Şekil 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 51.937 / 51937fig3highres.jpg&quot; /&gt; 2-1 çıkarma Şekil 3. Çift referans. (A) çoğaltır (yani, Fc = 2-1) boş enjeksiyon. (A) &#39;daki gibi, (B) yalnızca analit enjekte edilir. (C) (B) &#39;de ölçülen yanıtından (A)&#39; da gösterilen, zemin yanıtı çıkarıldıktan sonra Nihai öz sensogramlar. Bu eğriler &#39;çift boşluklu &quot;veya&quot; çift başvurulan &quot;olarak adlandırılır. Çoğaltır ardışık döngü vardır. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/51937/51937fig4highres.jpg" /> . 1 Langmuir etkileşim modeli: Şekil (çiftleri olarak) birden fazla analit konsantrasyonlarının enjeksiyonları ile kinetik hız sabitleri 4. belirlenmesi siyah çizgiler basit 1 kullanılarak hesaplanmıştır uyuyor vardır.

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR at JoVE.com

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) gerçek zamanlı biyomoleküler etkileşimlerini tespit etmek için bir etiket içermeyen bir yöntemdir. Burada, bir membran proteini için bir protokol: tekniğin artılarını ve eksilerini tartışırken reseptör etkileşimi deney, tarif edilmektedir.

Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

real-time-measurements-membrane-proteinreceptor-interactions-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

22.6K Görüntüleme.  The Technion-Israel Institute of Technology.  Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) gerçek zamanlı biyomoleküler etkileşimlerini tespit etmek için bir etiket içermeyen bir yöntemdir. Burada, bir membran proteini için bir protokol: tekniğin artılarını ve eksilerini tartışırken reseptör etkileşimi deney, tarif edilmektedir. 

Video: Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Biyoloji

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Floresans Rezonans Enerji Transferi Ligand-reseptör etkileşimleri gerçek zamanlı izleme

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS)

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Plazma Retinol Bağlayıcı Protein Membran Reseptör tarafından Retinol Ulaştırma Gerçek zamanlı Analizleri

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Sorunlu Tesisi, Oomiçet ve fungal Örnekleri için Elektron Mikroskobu (SEM) Protokoller tarayarak

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...