Biz laringeal cerrahi tekniği öğretmek için, Kobe Üniversitesi, Japonya Dr. Toshio Terashima teşekkür ve PRV-Bartha temini için Princeton Üniversitesi&#39;nden Dr. Lynn Enquist. Araştırma Erich Jarvis D. NIH öncü ödülü DP1 OD000448 ve Gustavo Arriaga bir NSF Lisansüstü Araştırma Bursu ödülü ile desteklenmiştir. Uygun kredili önceki çalışmalarından Rakamlar derginin editoryal politikalarına uygun PLoS ONE açık erişim Creative Commons lisansı (CC-BY) altında kullanılmaktadır.

NOT: Tüm hayvan prosedürleri gözden geçirilecek ve Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. Depolama Pseudorabies&#39;e Virüs <ol><li> Biz 1 x 10 9 pfu / m titrede Princeton Üniversitesi&#39;nden Dr. Lynn Enquist laboratuvar canlı virüsü (PRV152) edinin. Virüs üretmek için bir protokol 2 yayımlanmıştır. </li><li> Uygun biyogüvenlik koşulları altında -80 ° C&#39;de BSL-2 biyogüvenlik kabini ve mağaza içindeki tüp başına 20 ul virüs alikotu. </li><li> Hemen enjekte önce PRV bir kısım çözülme. </li></ol> Muscle içine Enjeksiyonlar 2. Cerrahi Hazırlık <ol><li> (100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg ksilazin) ketamin-ksilazin intramüsküler enjeksiyon yoluyla, genel anestezi neden ve izofloran kullanılarak uygun bir anestezik düzlemi korumak. </li><li> Bir oftalmik merhem ile korneaları koruyun. </li><li> T hazırlayınsaç kesme ve alternatif Betadine scrubs ve% 70 alkol (3 döngü az) ile cerrahi siteyi dezenfekte tarafından aseptik tekniğe uygun diye cerrahi alan. Cerrahi alanları kapsayacak şekilde steril örtüler kullandığınızdan emin olun. Prosedürler boyunca steril tekniklere uymak için emin olun. </li><li> Bir cilt kesi yapmak ve ilgi kas ortaya koymaktadır. Örneğin, ilk sternohyoid kas örten kısmını çıkarmak için gerekli olan krikotiroid gırtlak kası erişmek için. </li><li> VetBond doku yapıştırıcısı ile herhangi transected kasları kapatın. </li></ol> Muscle içine PRV 3. Enjeksiyon <ol><li> 34 G paslanmaz çelik iğne takın, taze çözülmüş PRV çözeltisi ile 10 ul Nanofil mikroenjektör sistemini yükleyin ve özenle stereotaksik cihaz üzerinde monte edin. </li><li> Yavaşça ölü boşluğu temizlemek ve bu çözüm mikroenjektör ucu çıkar doğrulayın. Bioharzard atık olarak sıvı atın. </li><li> Bir stereotaksik microp kullanılmasıositioning cihazı dikkatlice ilgi kasına mikroenjektör ucu yerleştirin ve hafif şişlik görülebilir olana kadar yavaş yavaş kas doldurun. Kas ve birimin boyutuna bağlı olarak değişir enjeksiyon oranı enjekte edilecek. Örneğin, 4 nl / sn bir hızda 200 nl (1 ul toplam) beş enjeksiyonları krikotiroid kas doldurmak için aynı sitede 1 dakika arayla yapılmalıdır. Ilgi sonraki kas şırınga (bu durumda yanal krikoaritenoid) hareket ettirin ve enjeksiyon işlemi tekrarlayın. Sadece bir kez, her kas delinme. </li><li> Beş dakika sonra mikroenjektör geri çekin. </li><li> VetBond doku yapıştırıcı kullanılarak fasya mola Seal. </li><li> Tüm enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, VetBond doku yapıştırıcı kullanılarak yarayı kapatmak. Yerel institional hayvan kullanım yönergelerine, dikiş veya yara klipleri bağlı kullanılabilir. </li><li> Sternum yatma kadar hayvan izleyin ve analjezi, gıda, su sağlamak ve y gereği olarak bakımkurumsal hayvan kullanımı kurallar. </li><li> Deneysel olarak belirlenen yaşam süresinden sonra (bu durumda, 90 saat 2 etiket nd kortikal nöronların sipariş), pentobarbital doz aşımı ile hayvan kurban ve 0.1 M PBS içinde% 4 formaldehit, ardından% 0.9 tuzlu su ile transcardially serpmek. </li><li> Çıkarın ve 24 saat süreyle% 4 formaldehit beyin post-düzeltin. </li><li> En az 48 saat süre ile% 30 sukroz ihtiva eden fosfat tamponu içinde beyin cryoprotect. </li></ol> EGFP 4. immunokimyasal Algılama <ol><li> Sürgülü mikrotomda 40 mikron bölümleri kesmek ve 0.1M PBS içine yüzen bölümleri kaydedin. Monte edilmiş bölümleri kullanılarak boyanması daha ince bölümleri, örneğin, 30 um için kullanılabilmektedir. </li><li> Işıktan koruyarak PBS içinde% 0.3, H2O 2 30 dakika boyunca bölümler söndürülür. </li><li> PBS VECTASTAIN Elit Kit normal keçi serumu ile% 0.3 Tween 20 ihtiva eden 30 dakika boyunca bölümler halinde spesifik olmayan antijenleri engelle (kiti VE). </li><liRT&#39;de:&gt; inkübe tavşan 3,5 saat boyunca anti-eGFP (1000 1) bölümleri engelledi. </li><li> RT de kiti VE den daha sonra keçi anti-tavşan ikincil antikor, 1 saat boyunca inkübe, 5 dakika boyunca kısımlar PBS ile üç kez yıkanır. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre kit VE ABC çözeltisi hazırlayın. </li><li> RT de kiti VE den daha sonra ABC çözeltisi içinde 1 saat süre ile reaksiyona bunları, 5 dakika boyunca kısımlar PBS ile üç kez yıkanır. </li><li> % 0.05 DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidin) ve% 0.015 H2O 2 ihtiva eden, 10 dakika süre ile fosfat tamponu içinde olan bölüm üç kez yıkayın ve fosfat tampon maddesi içinde 8 dakika, pH 7.4 gelişir. </li><li> Kademeli alkol serisi ile Dağı SuperFrost artı slaytlar üzerinde bölümleri ve kuruturlar (% 70,% 95,% 100 ve 5 dakika her biri için,% 100). </li><li> İki ksilen yıkar (5 dk) ile bölümleri temizleyin ve Permount montaj ortamı ile slaytlar lamel. </li><li> Görüntü mikroskop üzerine monte bölümler. DAB reaksiyon ürünü inside hücreler kahverengi görünmelidir. Sayısallaştırılmış görüntüleri ince süreçleri vurgulamak için ters bir renk olabilir. </li></ol> PRV İzleme tarafından keşfedilen Beyin Bölgeler içine izleyicilerin Enjeksiyon için 5. Cerrahi Hazırlık <ol><li> (100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg ksilazin) ketamin-ksilazin intramüsküler enjeksiyon yoluyla, genel anestezi neden ve izofloran kullanılarak uygun bir anestezik düzlemi korumak. </li><li> Bir oftalmik merhem ile korneaları koruyun. </li><li> Uygun bir stereotaksik çerçeve içinde kafası sabitleyin. </li><li> Saç kesme ve alternatif Betadine scrubs ve% 70 alkol (3 döngü az) ile site dezenfekte ederek aseptik tekniğe uygun cerrahi siteyi hazırlayın. </li><li> Bir kafa derisi kesi yapmak ve ilgi beyin bölgesi üzerindeki deriyi geri çekin. </li><li> Uygun stereotaksik koordinatlarda küçük bir kraniotomi gerçekleştirin. Örneğin, PRV bir izlemeyi tespit laryngeally bağlanan motor korteks koordinatların erişkin fare 1,2 mm yanal ve bregmaya 0.2 mm rostral bulunmaktadır. </li></ol> Beyin içine Biyotinilat Dekstran Aminler 6. Enjeksiyon <ol><li> Steril tuz 333 ul BDA 25 mg (10.000 MW) eritilmesi ile% 7.5 biyotinlenmiş dekstran aminler (BDA) hazırlayın. </li><li> Planlanan enjeksiyonlar için yeterli BDA çözeltisi ile Nanoject II mikropipet sistemi yükleyin. </li><li> Yavaşça ölü boşluğu temizlemek ve bu çözüm mikropipet ucu çıkmadan doğrulayın. </li><li> Stereotaksik micropositioning cihazı kullanarak dikkatlice ilgi beyin bölgesi içine mikropipet ucu düşürmek ve yavaş yavaş BDA enjekte edin. Bölgenin büyüklüğüne bağlı olarak enjeksiyon oranı etiketlenmesine ayarlayın. Örneğin, 4.6 nl 12 enjeksiyonları dışında 0.2 mm (postero-kaudal yönde) yetişkin farelerde laryngeally bağlı motor korteks kapsayacak şekilde dört farklı konumlarda olması yaptırdı olmalıdır. Nihai enjeksiyon hacmi ilgi beyin bölgesinin boyutuna göre ayarlanabilir olmalıdırEtiket beyin dokusu sayesinde ve etiketli nöronların süreçler boyunca difüzyon ile enjeksiyon çekirdek yayılabilir akılda tutmak. </li><li> Diş çimento kullanarak kraniotomi Seal ve VetBond doku yapıştırıcı kullanılarak kafa derisi yarayı kapatmak. </li><li> Sternum yatma kadar hayvan izleyin ve analjezi, gıda, su sağlamak, ve kurumsal hayvan kullanımı kurallarına gereği önemsiyorum. </li></ol> Kas içine kolera toksin alt-birimlerinin b 7. Enjeksiyon <ol><li> Steril tuzlu su, 100 ul CTB, 1 mg çözülmesiyle 1% kolera toksin alt-birimlerinin b (CTB) hazırlayın. </li><li> Altı gün beyine BDA enjeksiyonundan sonra, kas içine enjeksiyon için PRV yukarıda tarif edildiği gibi, cerrahi hazırlama gerçekleştirin. </li><li> 34 G paslanmaz çelik iğne takın, CTB çözeltisi ile 10 ul Nanofil mikroenjektör sistemini yükleyin ve özenle stereotaksik cihaz üzerinde monte edin. </li><li> Daha önce de olduğu gibi ilgi kas (lar) microinjections gerçekleştirinPRV için kayıtsız kalamayız. </li><li> Sternum yatma kadar hayvan izleyin ve analjezi, gıda, su sağlamak, ve kurumsal hayvan kullanımı kurallarına gereği önemsiyorum. </li><li> Üç gün CTB enjeksiyonundan sonra, pentobarbital aşırı doz hayvan kurban ve 0.1 M PBS içinde% 4 formaldehit, ardından% 0.9 tuzlu su ile transkardiyal serpmek. </li><li> Çıkarın ve 24 saat süreyle% 4 formaldehit beyin post-düzeltin. </li><li> En az 48 saat süre ile% 30 sukroz ihtiva eden fosfat tamponu içinde beyin cryoprotect. </li></ol> Aynı bölümlerde BDA ve CTB 8. Algılama <ol><li> Bir mikrotomda 40 mikron bölümleri kesmek ve 0.1M PBS içine yüzen bölümleri kaydedin. </li><li> Işıktan koruyarak PBS içinde% 0.3, H2O 2 30 dakika boyunca bölümler söndürülür. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre kit VE ABC çözeltisi hazırlayın. </li><li> Daha sonra oda sıcaklığında, ABC çözeltisi içinde 1 saat süre ile reaksiyona bunları, 5 dakika boyunca PBS içinde olan bölüm üç kez yıkayın. </li&gt; <li> 10 dakika boyunca fosfat tamponu içinde olan bölüm üç kez yıkayın, ve% 0.05 DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidin),% 0.015 H2O 2, ve% 0.05 nikel klorür içeren fosfat tampon maddesi içinde 8 dakika, pH 7.4 gelişir. Hücre içinde DAB reaksiyon ürünü siyah görünmelidir. </li><li> VECTASTAIN Elit Kit normal tavşan serumu ile Tween 20% 0.3 içeren PBS içinde 30 dakika boyunca blok bölümleri. </li><li> RT&#39;de: inkübe keçi 2 saat boyunca anti-CTB (10,000 1) bölümleri engelledi. </li><li> RT de kiti VE den daha sonra tavşan anti-keçi ikincil antikor, 1 saat boyunca inkübe, 5 dakika boyunca PBS içinde olan bölüm üç kez yıkayın. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre kit VE ABC çözeltisi hazırlayın. </li><li> Daha sonra oda sıcaklığında, ABC çözeltisi içinde 30 dakika boyunca, onları tepki, 5 dakika boyunca PBS içinde olan bölüm üç kez yıkayın. </li><li> % 0.05 DAB (3, 3 ihtiva eden, 10 dakika boyunca kısımlar fosfat tamponu içinde üç kez yıkayın ve fosfat tamponu içinde 8 dakika, pH 7.4 için geliştirmek&#39;-diaminobenzidine) ve% 0.015 H2O 2. Hücre içinde DAB reaksiyon ürünü kahverengi görünmelidir. </li><li> Kademeli alkol serisi ile Dağı SuperFrost artı slaytlar üzerinde bölümleri ve kuruturlar (% 70,% 95,% 100 ve 5 dakika her biri için,% 100). </li><li> İki ksilen yıkar (5 dk) ile bölümleri temizleyin ve Permount montaj ortamı ile slaytlar lamel. </li><li> Görüntü mikroskop üzerine monte bölümler. </li></ol>

<ol>
	<li>Card, J. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, 1.51-1.5.28 (2001).</li><li>Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudorabies+virus+expressing+enhanced+green+fluorescent+protein:+a+tool+for+in+vitro+electrophysiological+analysis+of+transsynaptically+labeled+neurons+in+identified+central+nervous+system+circuits.">Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).</li><li>Aston Jones, G., Card, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+pseudorabies+virus+to+delineate+multisynaptic+circuits+in+brain+opportunities+and+limitations.">Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations.</a> Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).</li><li>Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+pseudorabies+virus+neuroinvasion+and+lethality+in+mice.">Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice.</a> Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).</li><li>Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+tracing+using+biotinylated+dextran+amines.">Pathway tracing using biotinylated dextran amines.</a> Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).</li><li>Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroanatomical+tract-tracing+3+(Chapter+10).">Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10).</a> Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).</li><li>Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylated+dextran+amine+as+an+anterograde+tracer+for+single+and+double+labeling+studies.">Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).</li><li>Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylated+dextran+a+versatile+anterograde+and+retrograde+neuronal+tracer.">Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer.</a> Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).</li><li>Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+neuronal+tracing+with+cholera+toxin+B+subunit:+comparison+of+three+different+visualization+methods.">Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods.</a> Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).</li><li>Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+circuitry+involved+in+the+regulation+of+whisker+movements.">Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements.</a> The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).</li><li>Bartha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+reduction+of+virulence+of+Aujeszkys+disease+virus.">Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus.</a> Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).</li><li>Kuypers, H., Ugolini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+as+transneuronal+tracers.">Viruses as transneuronal tracers.</a> Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).</li><li>Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+pathway+from+rat+vibrissa+motor+cortex+to+facial+motor+neurons+revealed+by+lentivirus-based+axonal+tracing.">Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).</li><li>Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input+output+organization+of+the+rat+vibrissal+motor+cortex.">Input output organization of the rat vibrissal motor cortex.</a> Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).</li><li>Hsu, S. M., Soban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+modification+of+diaminobenzidine+(DAB)+precipitation+by+metallic+ions+and+its+application+for+double+immunohistochemistry.">Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).</li><li>Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+avidin+biotin-peroxidase+complex+(ABC)+in+immunoperoxidase+techniques+a+comparison+between+ABC+and+unlabeled+antibody+(PAP)+procedures.">Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).</li><li>Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anterograde+neuroanatomical+tracer+biotinylated+dextran+amine+comparison+with+the+tracer+Phaseolus+vulgaris+leucoagglutinin+in+preparations+for+electron+microscopy.">The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).</li><li>Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+architecture+of+nucleus+ambiguus+motoneurons+projecting+to+the+upper+alimentary+tract+in+the+rat.">Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).</li><li>Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+birds+and+men+the+mouse+ultrasonic+song+system+has+some+features+similar+to+humans+and+songlearning+birds.">Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds.</a> PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).</li><li>Card, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+the+use+of+pseudorabies+virus+in+transneuronal+studies+of+neural+circuitry.">Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).</li><li>Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudorabies+virus+glycoprotein+gIII+is+a+major+target+antigen+for+murine+and+swine+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes.">Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes.</a> Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).</li><li>Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinvasiveness+of+pseudorabies+virus+injected+intracerebrally+is+dependent+on+viral+concentration+and+terminal+field+density.">Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density.</a> The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).</li><li>Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+injection+of+the+attenuated+pseudorabies+virus+PRV+Bartha+results+in+infection+of+the+hamster+suprachiasmatic+nucleus+only+by+retrograde+transsynaptic+transport+via+autonomic+circuits.">Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).</li><li>Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+use+bidirectional+fast+axonal+transport+to+spread+in+sensory+neurons.">Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

PRV152 4,21 kullanarak bir deney planlanırken dikkate alınması gereken konulardan bir dizi vardır. Daha da önemlisi, pseudorabies virüs öldürücü. Daha önce belirtildiği gibi, insanlar da dahil olmak üzere büyük maymunlar, enfeksiyona duyarlı değildir, ancak uygun bakım diğer hayvanları korumak için dikkatli olunmalıdır. Yetişkin farelerde tipik haliyle beş ila yedi gün, zayıflatılmış PRV152 suşu ile aşılamadan sonra hayatta. Bu nedenle, PRV152 bir haftadan daha uzun bir hayatta kalma süresi gerektirir deneyler için uygun değildir. Ayrıca, enfekte hayvanların tipik böylece normal davranış gözlem gerektiren deneyler için PRV152 yararını sınırlayan, yaşam süresi boyunca hastalık belirtileri gösterir. Buna ek olarak, PRV152 bir sitotoksik immün tepkisini 22 tetikler. Çoğaltma ve virüsün bulaşma zamana bağlı 4 titer- ve olduğundan, nöronların desen vira immünokimyasal tespiti ortayaHücreler enfeksiyon aşamaları yoluyla ilerleme olarak l proteinler veya eGFP raportör gen yaşam dönemi boyunca değişecektir. Beş gün kas aşılamadan sonra, 3. veya 4. sırası nöronlar tespit edilebilir, ancak ilk enfekte nöronlar apoptotik hale gelebilir. Bu nedenle en iyi hayatta kalma süresi her bir çalışma için deneysel olarak tespit edilmelidir. Bir devre boyunca enfeksiyonun ilerlemesi ve hücre veya hayvan ölümü riski olmadan ilgi belirli nöronlar etiketleme için en iyi zaman noktasını belirlemek için bir zaman serisi analizi gerçekleştirmek için tavsiye edilir. PRV ile etiketleme başarısını etkileyen en önemli faktörlerden biri, viral titre olduğunu. 1,4 x 05-7 Ekim x 10 4 pfu / ml 23&#39;ten PRV-bartha titresini azaltılması enfekte olmuş hücrelerin sayısında belirgin azalmalar bildirilmiştir. Bu nedenle, biz 1 x 10 7 pfu / ml ve tutma aliquoted vi yukarıdaki kullanarak titreleri tavsiyerus -80 ° C onun enfeksiyon korumak için kullanılan transfer edilir. Yüksek titresi kullanırken bile, bir değil, tüm hücre tipleri enfeksiyon müsamahakar olabileceğini akılda tutmak gerekir. Bu nedenle, PRV izleme tarafından belirlenen hücreleri enfekte hedef girdilerin tamamıyla temsil olmayabilir. Açıklanan yöntem çok sinaptik devreler aracılığıyla çevresel hedefleri, özellikle kasları, düzenleyen merkez eferent nöronları analiz PRV yararı üzerinde duruluyor. Onlar da periferik aşılama ile enfekte olabilir, çünkü böyle görsel ve 24 otonom olarak diğer nöral devreler, bu teknik için uygundur. Ancak, PRV ön incelemede 3 yoğun tartışıldığı gibi bazı konular dikkatle göz önüne alındığında merkezi sinir sistemine doğrudan enjeksiyon için etkin bir şekilde kullanılmaktadır. Bu yazarlar PRV-Bartha ve ilgili suşları yoğun identifyi için PRV152 de uygun hale enfekte nöronların dendritik milleri doldurmak sözng uzak dentritlere afferentler koldan. Virüsün bu özelliği genellikle konvansiyonel işaretleyicilerle incelenmiştir hücre gövdesi bölgenin dışında bulunan uzak dendritlerin girdi bir ön liste deducing için açıklanan teknik özellikle kullanışlı hale getirir. Periferik hedeflerden izleme yaparken, sempatik innervasyon olası şaşırtmak düşünülmelidir. Bu nedenle, biz başlangıçta sempatik girdi PRV etiketleme sonuçlarının yorumlanmasını etkileyecek belirlemek için normal ve sympathectomized hayvanlarda etiketleme desenleri karşılaştırarak öneririz. Immünohistokimya gerek kalmadan floresan mikroskobu kullanarak, doğrudan görüntülü olabilir PRV152 tarafından ifade eGFP virüslü hücrelerin sinyali; Bununla birlikte, bu sinyal foto-ağartma tabidir ve zamanla düşer. DAB yolu izleme için boyama ile kombine immünohistokimya ana avantajı reaksiyon ürünlerinin kalıcı doğasıdır. Bunun i ikenayrıca enfekte hücrelerin tespit etmek için viral proteinlere karşı antikorlar kullanmak mümkündür, farklı viral öğeler mutlaka birbirleri ile 25 ya da eGFP sinyali ile birlikte lokalize olmaz. Bu nedenle, biz floresan tarafından gözlemlenen etiketleme desen korumak için eGFP karşı antikorlar kullanmanızı öneririz. Virüslü bir hücreye tüm afferentler uzak dendrit temas da dahil olmak üzere virüs transsinaptik geçişi için kanallar olma ihtimali olduğu için, biz önemli güvenilir tespit devredeki röle sonraki onay için böyle dendrit lekeleri geleneksel izleyici seçmek için düşündü. Bu amaçla CTB seçilmiş ve dendritler iyi boyama ve çevresindeki nöropilde ve motor korteksten inen aksonlarla hem güçlü kontrast sağlar bulundu. O lekeli akson ve hücre gövdeleri renklerini (BDA = kahverengi; CTB = siyah) tersine mümkün olsa da, biz siyah iyi co sağladığını bulmakntrast ince kalibre aksonlar görselleştirmek için. BDA etiketleme desenleri yorumlanırken akılda tutulması gereken önemli bir nokta BDA10kDa ağırlıklı anterograd izleyici olarak kullanılır, aynı zamanda retrograd (Şekil 6) 6 hücreleri etiketlemek olabilir. Ayrıca, daha sonra başka bir terminal BDA sitesine bir akson teminat boyunca dağıtılmış bir hücreye retrograd nakledilebilir. Bu akson teminatlar enjekte bölgenin projeksiyon hedefle aynı bölgede varsa, o zaman anterograde etiketleme onları ayırt etmek zordur. Son bir teknik not 34 G Nanofil metal şırınga, ince kalibre daha iyi performans kas içine enjekte izleyiciler için cam pipet çekti, ama küçük hayvanlarda intraserebral enjeksiyonlar için kullanıldığında çok mekanik hasara neden olmasıdır. Bu nedenle çevresel enjeksiyonlar için metal şırınga ve merkez enjeksiyonlar için cam pipet kullanmanızı öneririz.

Transsinaptik izleme multi-sinaptik devreler aracılığıyla çevresel hedefleri düzenleyen santral eferent nöronları analiz etmek için kullanılan güçlü bir araç haline gelmiştir. Bu yaklaşım en yaygın, özellikle zayıflatılmış suş PRV-Bartha ilk kez 1961 yılında açıklanan domuz patojen pseudorabies virüsü (PRV), kullanılarak kemirgen beyinde kullanılmaktadır 12. Burada, belirli kasların motor kortikal temsilini belirlemek için bir protokol mevcut veya gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) raportör geninin 2 eksprese eden bir rekombinant pseudorabies virüs suşu (PRV152) ile kas grupları. Açıklanan yöntem çapraz sinaps fonksiyonel devre 3,4,13 içindeki diğer nöronlar bulaştırmak için bu bulaşıcı döl üreten nörotropik virüsler, davranışını patlatır. PRV-Bartha ile izojenik olan PRV152, sadece uzak enfeksiyon sitesinden 3,5 &lt;dan retrograd sinaptik bağlantıların hiyerarşik dizisi boyunca sinaps haçlar/ sup&gt;. Tam olarak enfeksiyonun periferal sitesi kontrol edilmesiyle motor nöronların spesifik bir alt kümesi üzerinden beyne virüs girişini sınırlamak mümkündür. Virüs sırayla bağlı nöronların zincirlerini bozar gibi, beynin boyunca eGFP sinyalinin ortaya çıkan desen sonra başlangıçta enfekte hücrelere bağlı olan nöronların ağı çözecektir. Nöral izleme için virüs kullanılarak bir başka avantajı, enfekte olmuş hücreler içinde raportör proteininin (bu durumda EGFP) amplifikasyonu olup. Bu sinyal amplifikasyon bile seyrek projeksiyonlar algılanmasını sağlar duyarlılık düzeyi sağlar. Örneğin, bıyık kontrol yüz motor nöronlara bıyık motor korteks bir seyrek projeksiyon viral ifade yeşil flüoresan protein 14 ile sıçanlarda bulundu; önceki çalışmalar raportör gen amplifikasyonu 11,15 olmadan klasik izleyiciler kullanarak bu projeksiyonu bulamadılar. Ne yazık kiBirçok viral izleme vektörleri belirtilen çalışmada kullanılan gibi, bu şekilde, çok-sinaptik devreleri izlemek için kullanımlarını sınırlamaktadır sinaps geçmez. Motor devresinde katılan hücrelerin ağını tanımlamak için farklı avantajlar sunarken, transsinaptik dağıtık yapısı PRV-152 zorlu devre içinde belirli bağlantıları yorumlama yapar ile izleme. Bu nedenle, biz biyotinlenmiş dekstran aminler (BDA) ve kolera toksini alt birimi b (CTB) kullanılarak çift etiketleme PRV-152 kullanılarak tespit devreler içinde belirli bağlantıları doğrulamak için basit bir yöntem mevcut. BDA ve CTB kombine kullanımının nöronlar 6-8,11 özel setler arasındaki bağlantıları izlemek için köklü bir yaklaşımdır. Birlikte kullanıldığında, bu iki izleyiciler iki renkli DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidin) prosedürü 16 kullanarak aynı bölümünde görülebilir. Yüksek molekül ağırlıklı BDA (BDA10kDa) bu protokol için seçildi bu y çünkünöron 6,7,9 ayrıntılı etiketleme ields. BDA10kDa diğer avantajları arasında aşağıdakiler bulunmaktadır: bu tercihan anterograd yönünde 6-8 taşınır; o iyontoforetik veya basınçlı enjeksiyon 6-8 teslim edilebilir; basit bir avidin biotinillenmemiş HRP (ABC) prosedürü 17 tarafından görüntülenmiştir olabilir; ve ışık veya elektron mikroskobu 6,7,18 tarafından görüntülenebilir. Distal dendritler 10,19 gibi hücresel süreçleri ortaya çıkartılmasında etkili olduğu için peroksidaz ve DAB ile CTB immünokimyasal algılama motor nöronlar retrograd etiketlenmesi için seçildi. Biz son zamanlarda farelerde vokal motorlu yolu belirlemek ve daha önce 20 eksik olarak kabul edildi laringeal motor nöronların, primer motor korteks gelen seyrek bir bağlantı ortaya çıkarmak için bu yaklaşımı kullanılır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil Microinjection System</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IO-Kit</td>
			<td>34 gauge option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VetBond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane (Forane)</td>
			<td>Baxter&#160;</td>
			<td>1001936060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Swab Stick</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>2130-01</td>
			<td>200 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated dextran amines</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-1956</td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudorabies virus</td>
			<td>Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)</td>
			<td>PRV152</td>
			<td>Titer &#62; 1 x 107</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin B Subunit</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP</td>
			<td>Open Biosystems</td>
			<td>ABS4528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3, 3&#39;-diaminobenzidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5905</td>
			<td>10 mg tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Dilute to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3410</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl &#38; Xylazine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>80 mg/mL &#38; 6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3619</td>
			<td>1.0 M; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10X; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3761</td>
			<td>50 mg/mL dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>Histological grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare opthalmic ointment</td>
			<td>Vet Depot</td>
			<td>1017992</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transsynaptic tracing from peripheral targets with pseudorabies virus followed by cholera toxin and biotinylated dextran amines double labeling

Transsinaptik izleme multi-sinaptik devreler aracılığıyla çevresel hedefleri düzenleyen santral eferent nöronları analiz etmek için kullanılan güçlü bir araç haline gelmiştir. Bu yaklaşım en yaygın domuz patojen pseudorabies virüsü (PRV) 1 kullanılarak beyinde kullanılmaktadır. PRV insanlar dahil olmak üzere büyük maymunları enfekte etmez, bu yüzden en yaygın küçük memeliler, özellikle kemirgenler üzerinde çalışmalarda kullanılmaktadır. Pseudorabies zorlanma PRV152 gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) raportör geni ifade ve sadece retrograd uzak enfeksiyon sitesinden 2,3 sinaptik bağlantıların hiyerarşik dizisi ile fonksiyonel sinapsların geçer. Diğer PRV suşları farklı mikrobiyolojik özelliklere sahip ve her iki yönde (PRV-Becker ve PRV-Kaplan) 4,5 &#39;de taşınabilir. Bu protokol PRV152 münhasıran ele alacağız. Böyle kas gibi, periferik yerinde virüsü teslim ederek, t içine virüsün girişini sınırlamak mümkündürnöronların belirli bir set üzerinden beyni. Beyin boyunca eGFP sinyalinin elde edilen şablon, bu durumda başlangıçta enfekte olan hücrelere bağlı nöronların giderir. Pseudorabies virüs transsinaptik izleme dağıtık yapısı zor bir tanımlanmış bir ağ içinde belirli bağlantı yorumlama yapar, biz kullanılarak tespit hücreleri arasındaki bağlantıları teyit için biyotinli dekstran aminler (BDA) ve kolera toksini alt birimi b (CTB) kullanılarak hassas ve güvenilir bir yöntem sunmak PRV152. Onlar uzak dendritler 6-11 olmak üzere hücresel süreçleri ortaya etkilidir çünkü peroksidaz ve DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidin) ile BDA ve CTB immunokimyasal tespiti seçildi.

EGFP için boyama kasına PRV152 enjekte sonra birincil motor nöronların yaklaşık 72 saat zayıf sinyali gösteren başlamalıdır. Çoğaltma ve virüsün transsinaptik taşıma titer- ve zamana bağlı 4 bulunmaktadır. Yaklaşık 90 saat enjeksiyonundan sonra, eGFP boyama 2. sırası ile enfekte hücrelerde sağlam sinyal ortaya çıkaracaktır. Daha uzun yaşam süreleri 3 rd ve yüksek mertebeden hücreleri ortaya çıkaracaktır ama sağkalım süreleri yaklaşık 5 gün aşılamadan sonra PRV ölümcül ile sınırlıdır. Şekil 1a PRV152 laringeal motor nöronları, yedi laringeal kasların ikiye PRV152 enjeksiyonundan sonra 94 saat evler nukleus ambiguus içinde eGFP ifade ile enfekte nöronlar gösterir. Virüs enfekte kasları gibi hipoglosal nükleus gibi diğer phonatory motor nöron havuzları, innerve nöronların yoluyla beyne girilen Çünkü eGFP ifade etmeyen (Şekil 1b). <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Şekil 2 çekirdek ambiguus birincil enfeksiyondan sonra 2. sipariş beyin sapı nöronların virüsün retrograd transport. Enjeksiyon tek taraflı ve beyin sapında etiketin elde edilen model aynı taraftaki çekirdekte ambiguus ve hücre çekirdeği (Şekil 2a) enfeksiyon gösterir. Retiküler internöron da enfekte ve eGFP (Şekil 2b) için güçlü boyandı. Bu internöron phonatory motor nöron havuzları ve kontralateral çekirdek ambiguus dahil olmak üzere çeşitli yapıları bağlamak; virüs sadece retrograd yönde yayılır, çünkü ancak onların efferent hedefleri etiketsiz kalır. Şekil 3 periferik enjeksiyon sitesine eGFP kontralateral ifade motor kortekste enfekte premotor nöronlar gösterir. PRV152 çekirdeği ambiguus laringeal motor nöronları üzerinde çarpan çok sinaptik devreler yoluyla yayılır, çünkü olabilir be laringeal kas motor kortikal temsilini oluşturan hücrelerin sadece nüfus enfekte olduğunu varsaydık. (Ve ön beyin çoğu gösterilmemiştir) gösterilen bölümün geri kalanında eGFP sinyal eksikliği etiketleme özgüllüğünü göstermektedir. Şekil 4 çekirdek ambiguus düzeyinde beyin sapındaki aksonlar BDA etiketli gösterir. Aksonlar retrograd laringeal kas içine enjeksiyonlar etiketli CTB-pozitif motor nöronlar ile temas. Aksonlar laringeal motor nöron varicosities ve dendrit yakın varsayılan Terminal boutons ve soma oluşturan gösterilmektedir. Elektron mikroskobu ya da elektrofizyoloji kullanarak ayrıntılı deneyler bu varisler sinaptik boutons temsil olup olmadığını belirlemek için gereklidir. Şekil 5a PRV152 ile izleme retrograd transynaptic tarafından tanımlanan laryngeally bağlı motor korteks yerleştirilen BDA ikili enjeksiyon gösterir. Bec<html> ause BDA hem afferent ve efferent bağlantıları etiketlenebilir, yönsel spesifik değildir. Örneğin, bir projeksiyon alanı (anterograd) ve hücre gövdeleri hem (retrograd) etiketi talamus görülür (Şekil 5b). <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/50672/50672fig1.jpg" /> Şekil 1: PRV152 (a) ambiguus (Amb) &#39;de eGFP (yeşil) ve Kolin Asetiltransferaz immünopozitif motonöronlannda (kırmızı) ifade ile Enfekte Nöronlar ve (b) içine PRV152 Enjeksiyon sonrası Fare Beyin Sapı 94 saatlik Hipoglossal (XII) Çekirdekler krikotiroid ve Yanal krikoaritenoid laringeal kasları. RF = retiküler formasyon. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50672/50672fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html> g2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2:. Krikotiroid ve Yanal krikoaritenoid laringeal Kaslar içine PRV152 enjekte sonra fare 86 saatlik Beyin Sapı içinde Psuedorabies Virüsü (PRV152) Enfeksiyon (a) Nöronlar geliştirilmiş ifade eden yeşil flüoresan protein (beyaz, lekeli bölümler orijinal aydınlık görüntüleri ters renkler ) enjekte kas nükleus ambiguus (Amb) ipsilateral, çevredeki retiküler formasyon (RF) ve yalnız çekirdek (Sol), fakat hipoglosal çekirdeği (XII). (B) Amb ve yüksek büyütmede retiküler internöron (kırmızı oklar, RF hücre gövdeleri). Ölçek çubukları: bir 1 mm; B 100 um. (Arriaga ve ark. 2012 den Modifiye). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50672/50672fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> tp_upload / 50672 / 50672fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3:. Kortikal Piramidal nöronlar eGFP (beyaz, lekeli bölümler orijinal aydınlık görüntüleri ters renkler) ifade krikotiroid ve Yanal krikoaritenoid laringeal Kaslar içine Psuedorabies Virüsü (PRV152) Enjeksiyon aşağıdaki M1&#39;in Kortikal Tabaka V Ölçek çubukları: 1 mm ana panel; Girintinin 200 um. (Arriaga ve ark dan Modifiye. 2012). <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50672/50672fig4.jpg" /> Şekil 4:. Beyin Sapı M1 Aksonlar (a) M1 içine BDA bir enjeksiyon laringeal kasları ve M1 akson (siyah) bir enjeksiyon Amb (kahverengi) CTB-etiketli motor nöronların içeren koronal beyin bölümünün Düşük güç. BDA etiketli aksonlar kortiko-piramit (Pir) parça görülebilir. Kısaltmalar: Amb, nukleus ambiguus; Pyr, piramitler; HÖH, reticular oluşumu doğrudan Amb medial; DRF, Amb için retiküler formasyon dorsal. (B) BDA Yüksek büyütme bir Amb motor nöronlar (CTB kahverengi) üzerine kontakt (ok) yapar M1 akson (siyah ok başları) etiketli. (C) M1 aksonlar (siyah) (oklar) boyunca çalışan ve yakın (ok başları) Amb dışarı yayar büyük Amb motor nöron dendrit. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50672/50672fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/50672/50672fig5.jpg" /> Şekil 5: Enjeksiyon sitesi ve PRV transynaptic izleme görülmeyen BDA enjeksiyonları ortaya ek iki yönlü bağlantıları. (a) primer motor korteks (M1) bilateral biyotinlenmiş dekstran amin (BDA) enjeksiyonları (siyah) altta yatan striatum yoğun terminali projeksiyon alanı (siyah) saptandı. (b) CortiM1 cal aksonlar talamus (VL) ventral lateral nukleus içinde sona; Talamik hücreler bir küme (koyu kahverengi ve beyaz ok başkanı tarafından işaretlenmiş) geri M1 şarkı bölgeye bu proje aynı zamanda VL görülmektedir. Iç kapsül (IC) korteks gelen aksonlar etiketli etti. Ölçek çubukları: bir 1 mm; B 200 um. (Arriaga ve ark. 2012 den Modifiye). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50672/50672fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling at JoVE.com

Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

Transsinaptik Kolera Toksin ve Biotinlenmiş Dekstran Aminler Çift Etiketleme Ardından Pseudorabies&#39;e Virüs ile Periferik Hedefler gelen İzleme

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

transsynaptic-tracing-from-peripheral-targets-with-pseudorabies-virus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K Görüntüleme.  Duke University Medical Center. Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

Video: Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Nörobilim

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus (RABV), and more recently vesicular stomatitis virus (VSV), for studying circuitry, is becoming increasingly popular. These higher throughput methods use viruses that transmit between neurons in either the anterograde or retrograde direction.
Recently, a modified RABV for monosynaptic retrograde tracing was developed. (Figure 1A). In this method, the glycoprotein (G) gene is deleted from the viral genome, and resupplied only in targeted neurons. Infection specificity is achieved by substituting a chimeric G, composed of the extracellular domain of the ASLV-A glycoprotein and the cytoplasmic domain of the RABV-G (A/RG), for the normal RABV-G1. This chimeric G specifically infects cells expressing the TVA receptor1. The gene encoding TVA can been delivered by various methods2-8. Following RABV-G infection of a TVA-expressing neuron, the RABV can transmit to other, synaptically connected neurons in a retrograde direction by nature of its own G which was co-delivered with the TVA receptor. This technique labels a relatively large number of inputs (5-10%)2 onto a defined cell type, providing a sampling of all of the inputs onto a defined starter cell type.
We recently modified this technique to use VSV as a transsynaptic tracer9. VSV has several advantages, including the rapidity of gene expression. Here we detail a new viral tracing system using VSV useful for probing microcircuitry with increased resolution. While the original published strategies by Wickersham et al.4 and Beier et al.9 permit labeling of any neurons that project onto initially-infected TVA-expressing-cells, here VSV was engineered to transmit only to TVA-expressing cells (Figure 1B). The virus is first pseudotyped with RABV-G to permit infection of neurons downstream of TVA-expressing neurons. After infecting this first population of cells, the virus released can only infect TVA-expressing cells. Because the transsynaptic viral spread is limited to TVA-expressing cells, presence of absence of connectivity from defined cell types can be explored with high resolution. An experimental flow chart of these experiments is shown in Figure 2. Here we show a model circuit, that of direction-selectivity in the mouse retina. We examine the connectivity of starburst amacrine cells (SACs) to retinal ganglion cells (RGCs).

A method of tracing synaptically connected neurons is described. We use TVA specificity of an upstream cell to probe whether a cell population of interest receives synaptic input from genetically defined cell types.

Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Floresan Boyalar Yetişkin Zebra balığı Retina Ganglion Hücreleri retrograd Etiketleme

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

Floresan Nöronal Dokularda Kalıcı DNA Virüs Genomu ve Transkriptlerinin Algılama In situ Melezleme immün ile birlikte

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Embriyonik Fare beyninde İzleme Koşullu Genetik transsinaptik

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Aynı Sunucu Türlerin Antikorlar ile İmmünohistokimya ve Çoklu Etiketleme Yetişkin hipokampal nöron Eğitim için

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of its labeling was affected by various factors, here, we provide a refined protocol for the application of high molecular weight BDA for studying optimal neural labeling in the central nervous system. After stereotactic injection of BDA into the ventral posteromedial nucleus (VPM) of the thalamus in the rat through a delicate glass pipette, BDA was stained with fluorescent streptavidin-Alexa (AF) 594 and counterstained with fluorescent Nissl stain AF500/525. On the background of green Nissl staining, the red BDA labeling, including neuronal cell bodies and axonal terminals, was more distinctly demonstrated in the somatosensory cortex. Furthermore, double fluorescent staining for BDA and the calcium-binding protein parvalbumin (PV) was carried out to observe the correlation of BDA labeling and PV-positive interneurons in the cortical target, providing the opportunity to study the local neural circuits and their chemical characteristics. Thus, this refined method is not only suitable for visualizing high quality neural labeling with the high molecular weight BDA through reciprocal neural pathways between the thalamus and cerebral cortex, but also will permit the simultaneous demonstration of other neural markers with fluorescent histochemistry or immunochemistry.

Here, we present a refined protocol to effectively reveal biotinylated dextran amine (BDA) labeling with a fluorescent staining method through a reciprocal neural pathway. It is suitable for analyzing the fine structure of BDA labeling and distinguishing it from other neural elements under a confocal laser scanning microscope.

Yüksek molekül ağırlıklı Biotinylated Dextran Amin uygulama içinde sıçan izleme Thalamocortical projeksiyon için geliştirmek

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...