Biz transmisyon elektron mikroskobu için yardım Stephan Wilkens teşekkür ederim. Bu çalışma Sağlık Hibe R01AG023731 Ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Önceki çalışmalar Mgm101 ilk amino terminal kalıntıları 22 mitokondri 19 içine aldıktan sonra yarıldığı gösterilmiştir. Escherichia coli içinde ekspresyonu için, ilk 22 kodonları eksik MGM101 açık okuma çerçevesi PCR ile amplifiye edilir ve ekspresyon vektörü üretilmesinde ise pMAL-C2E değiştirilmiş bir versiyonu maltoz bağlayıcı protein (MBP) kodlayan bir erkek sekansının aşağı yerleştirilir. Bu PreScission proteaz (Şekil 3), bir ayrılma yeri içeren bir bağlayıcı ile MBP-füzyon Mgm101 oluşturur. Plazmid ilk olarak E. seçerek inşa IPTG ve Xgal beyaz / mavi seçim olmadan coli transformantlar. Elde edilen plazmid üretilmesinde ise pMAL-C2E-MGM101 sonra E. sokulur coli ampisilin ve kloramfenikol dirençli koloniler seçerek BL21-CodonPlus (DE3)-RIL süzün. 1. İfade, İndüksiyon, Hücre Lizis ve DNaz I Tedavi <ol><li> Inocglikoz (% 0.2), ampisilin (100 ug / ml) ve kloramfenikol (50 ug / ml) ile desteklenmiş LB vasatı içinde 10 ml (% 1 Bacto Tripton,% 0.5 maya ekstresi,% 1 NaCl) taze transformantlar ulate. 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° CO / K &#39;de inkübe edilir. </li><li> Yukarıdaki gibi desteklenmiş LB vasatı içinde 2 litre içine 10 ml ön-kültür inoküle. OD 600 0.5 ulaşıncaya kadar sallayarak ile 37 ° C hücreleri büyütün. </li><li> 0.3 mM&#39;lik bir son konsantrasyonda izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) eklenerek MBP-Mgm101 füzyon proteininin ekspresyonunu. 5 saat 30 ° C&#39;de sallayarak hücreleri büyütün. </li><li> Bir Beckman JA-10 rotoru (5500 x g, 4 ° C, 10 dakika) kullanılarak santrifüj hücreleri toplamak. Atıldıktan sonra, süpernatan, proteaz inhibitörleri (25 uM löpeptin, 1 uM pepstatin A ve 1 mM PMSF) ihtiva eden liziz tamponu, 30 ml (20 mM Tris-HCI, pH 7.4 ve 1 mM EDTA, pH 7.4) içinde hücre pelletini. </li><li> 20 boyunca buz üzerinde hücre süspansiyonu sonikasyonsn ultrasonik işlemci (Isı Sistemleri; Model W-385) kullanarak 50% görev döngüsü, 30 saniye boyunca buz üzerinde serin ve 2x tekrar sağlar. </li><li> 2 mg / ml &#39;de 1 DNAz stoklar 1 ml ilave edilir. 2 saat boyunca 4 ° C &#39;de hücre lizatı sallayın. </li><li> 500 mM&#39;lik bir son konsantrasyona NaCl ayarlayın. </li><li> 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 10,000 x g&#39;de santrifüj ile hücre artıkları çıkarın. </li></ol> 2. Amiloz Affinity Kromatografi ile Arıtma <ol><li> Lizis tamponu içinde amiloz reçinesi (% 50 çamurlu) 1.5 ml dengelenmesi. Hücre lizatı ile dengelenmiş amiloz reçine ekleyin. 4 ° CO / N. de hafifçe sallayın </li><li> Soğuk bir odaya monte bir Econo-Kolon kromatografisi kolonuna lizat-reçine karışımı yükleyin. Ilişkisiz proteinler yerçekimi ile sütun geçmesine izin. </li><li> Yıkama tamponu I (, 400 mM NaCI, 1 mM EDTA, pH 7.4, ve 0.2 mM PMSF, 20 mM Tris-HCI, pH 7.4) 300 mL &#39;si ile yıkayınız amiloz reçine. </li><li> II yıkama tamponu (20 mM T 150 mL &#39;si ile yıkama tekrarlayınRIS-HCI, pH 7.4, 200 mM NaCI, 1 mM EDTA, pH 7.4, ve 0.2 mM PMSF). </li><li> Sütun, 4 &#39;de inkübe edilir 10 dakika boyunca ° C toplamak elüsyon tamponu, 5 ml (, 200 mM NaCI;, 1 mM EDTA, pH 7.4 ve 0.2 mM PMSF, 10 mM Maltoz, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4) ile ekleme daha fazla kez eluat ve tekrar. </li><li> Eluatlar birleştirin, Coomassie boyama (Şekil 4) tarafından izlenen bir SDS-PAGE jeli üzerinde eluatın bir kısım yükleyerek MBP-Mgm101 verimini ve saflığını belirlemek. </li></ol> 3. PreScission proteaz bölünme ve Katyon Değişim Kromatografisi <ol><li> MBP-Mgm101 elüatına PreScission proteaz 50 adet ekleyin. 4 de bölünme ° CO / N yapın ve (20 mM Tris-HCI, pH 7.4, 100 mM NaCI, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7.4, ve 0.2 mM PMSF) bu diyaliz tampon maddesine karşı diyaliz süresince devam etmesine izin </li><li> Bir SDS-PAGE jel (Şekil 5A) üzerinde bölünme verimini kontrol edin. </li><li> Birden enjekte tarafından bölünmüş MBP-Mgm101 YükBio-Ölçek Mini Makro-Hazırlık Yüksek S kartuşu iyonları bir Bio-Rad Biyolojik Çift Geçişli FPLC sistemine bağlı. </li><li> Bir adım tuzu 5 mM gradyan, 300 mM, 500 mM, 750 mM ve karıştırma tampon A (5 mM NaCI ile oluşturulur NaCl 1.000 mm uygulayarak, katyon değişim kromatografisi başlangıç;, 10 mM Na-fosfat, pH 7.2, 1 mM PMSF) ve Tampon B (1 M NaCI, 10 mM Na-fosfat, pH 7.2, 1 mM PMSF). 0.5 ml / dak akış hızı. Mgm101 fraksiyonu toplamak ve bir SDS-PAGE jel (Şekil 5B), proteinin saflığı gösterir. </li></ol> 4. Boyut Dışlama Kromatografisi <ol><li> Katyon değişim kromatografisinden protein fraksiyonları bir araya getirin. (150 mM NaCI, 1 mM EDTA, pH 7.4, 5 mM 2-merkaptoetanol, 0.2 mM PMSF, 20 mM MOPS, pH 7.0) GF dengeleme tamponu içinde protein Dialyze. </li><li> 4 ° C&#39;de 3000 xg&#39;de iplik ~ 1 ml hacmini azaltmak için Vivaspin 15R Ultrafiltrasyon spin kolon ile protein konsantre </li><li> Mgm101 o Yükna kromatografi tamponu (150 mM NaCI, 5 mM β-merkaptoetanol, 1 mM EDTA, pH 7.4, 0.2 mM PMSF, 20 mM MOPS, pH 7.0) ile dengelenmiş bir Superpose 6 prep kolon dereceli olarak kalibre edilmiştir. </li><li> 0.5 ml / dak &#39;lık bir akış hızında çalışırlar kromatografi tamponu ile boyut dışlama başlatın. </li><li> Saflaştırılmış Mgm101 tepe fraksiyonlar toplayın. Protein nihai kalitesini kontrol etmek için, bir% 12 SDS-PAGE üzerinde fraksiyonların alikotları yerleştirin. </li><li> Vivaspin 6 ile protein konsantre, sonra hızlı bir şekilde -80 sıvı N2 ve mağaza örnekleri dondurmak ° C </li><li> SsDNA bağlayıcı analizi (Şekil 8) ve transmisyon elektron mikroskobu (Şekil 9) ile yapısal görselleştirme için 6-12 ay içinde Mgm101 örnekleri kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+eukaryotic+homologous+recombination.">Mechanism of eukaryotic homologous recombination.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).</li><li>Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMC1:+a+meiosis-specific+yeast+homolog+of+E.+coli+recA+required+for+recombination,+synaptonemal+complex+formation,+and+cell+cycle+progression.">DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression.</a> Cell. 69, 439-456 (1992).</li><li>Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad51+protein+involved+in+repair+and+recombination+in+S.+cerevisiae+is+a+RecA-like+protein.">Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein.</a> Cell. 69, 457-470 (1992).</li><li>Passy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Dmc1+protein+binds+DNA+as+an+octameric+ring.">Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).</li><li>Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+E.+coli+recA+protein+monomer+and+polymer.">The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer.</a> Nature. 355, 318-325 (1992).</li><li>Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+structure+and+dynamics+in+the+helical+filaments+formed+by+RecA+and+Rad51+on+DNA.">Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).</li><li>Conway, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+Rad51+filament.">Crystal structure of a Rad51 filament.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).</li><li>Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+allele+of+RAD52+that+causes+severe+DNA+repair+and+recombination+deficiencies+only+in+the+absence+of+RAD51+or+RAD59.">A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59.</a> Genetics. 153, 1117-1130 (1999).</li><li>Bai, Y., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rad52+homolog+is+required+for+RAD51-independent+mitotic+recombination+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).</li><li>Paques, F., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+of+recombination+induced+by+double-strand+breaks+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).</li><li>Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+recombinases+in+bacteriophage+genomes+unveils+Rad52,+Rad51+and+Gp2.5+remote+homologs.">Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).</li><li>Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+structure+and+quaternary+organization+of+the+bacteriophage+P22+Erf+protein.">Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein.</a> J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).</li><li>Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rings+and+filaments+of+beta+protein+from+bacteriophage+lambda+suggest+a+superfamily+of+recombination+proteins.">Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).</li><li>Ploquin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+basis+for+a+bacteriophage+homolog+of+human+RAD52.">Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52.</a> Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).</li><li>Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MGM101,+a+nuclear+gene+involved+in+maintenance+of+the+mitochondrial+genome+in+Saccharomyces+cerevisiae.">MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).</li><li>Meeusen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mgm101p+is+a+novel+component+of+the+mitochondrial+nucleoid+that+binds+DNA+and+is+required+for+the+repair+of+oxidatively+damaged+mitochondrial+DNA.">Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA.</a> J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).</li><li>Mbantenkhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mgm101+is+a+Rad52-related+protein+required+for+mitochondrial+DNA+recombination.">Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination.</a> J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).</li><li>Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+properly+configured+ring+structure+is+critical+for+the+function+of+the+mitochondrial+DNA+recombination+protein.">A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein.</a> Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).</li><li>Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+core+of+the+mitochondrial+genome+maintenance+protein+Mgm101p+in+Saccharomyces+cerevisiae+determined+with+a+temperature-conditional+allele.">A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele.</a> FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).</li><li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+packaging+proteins+Glom+and+Glom2+coordinately+organize+the+mitochondrial+nucleoid+of+Physarum+polycephalum.">DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum.</a> Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).</li><li>Janicka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RAD52-like+single-stranded+DNA+binding+protein+affects+mitochondrial+DNA+repair+by+recombination.">A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination.</a> Plant J. 72, 423-435 (2012).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

E. bir istikrarlı, yerli rekombinant Mgm101 proteini üretmek için bir meydan okuma olmuştur bakteri hücrelerinin kendi çözünürlükten muhtemelen nedeniyle coli. Bu raporda, MBP-füzyon stratejisi protein oldukça yüksek bir seviyede ifade edilmesini sağlar olduğunu göstermektedir. Negatif boyama transmisyon elektron mikroskopisi ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak, daha önce MBP-füzyon proteininin in vitro 18 üniform oligomerleri oluşturur göstermiştir. Bu Mgm101 bir katlama ve oligomerizasyon mitokondrial matris ile karşılaştırıldığında bakteri hücreleri daha yavaş olabilir mümkündür. Unoligomerized Mgm101 hızla in vivo olarak toksik olan agrega oluşturabilir. MBP-etiketleme verimli oligomerizasyonu sağlar ve toksisite azalır bir çözünür yapısındaki Mgm101 devam edebilir. Kaliteli Mgm101 hazırlanması için önemli bir kriter DNA asgari kirlenme sahip olmaktır. A 280 / A <sub&gt; 260 oranında örneklerinde kirletici DNA seviyesini tahmin etmek için kullanılır. Tipik olarak, bir oran&gt; 1.4 kolayca nükleik asitlerin kirletici &lt;% 0,75 ile iyi bir kaliteye sahip olduğu kabul edilir, elde edilebilir. A 280 / A 260 oranı bu seviyenin altında ise, DNAz ile uzun sindirim ben tavsiye edilir. Gelecekte, bu S1 nükleaz ve RNaz ile sindirim daha fazla nükleik asit kirlenmesine neden azaltabilir olup olmadığını görmek için yararlı olabilir. Daha önce bir kaç hafta boyunca 4 ° C de Mgm101 depolanması uzun lifleri helezonî 17 oluşumunu uyardığını göstermiştir. Filament oluşum mekanizması iyi anlaşılamamıştır. Aşırı ipliklerin proteinin çözünürlüğünü etkiler. Bu nedenle, güçlü bir şekilde taze hazırlanmış Mgm101 protein alikotları hızlı bir şekilde -80 depolamanın ardından, sıvı nitrojen içinde dondurulur ve tavsiye edilir ° C Proteininin DNA bağlama aktivitesi saklama u 6-12 ay sonra değişmediBu koşullar vardılar. Bu protokol, aynı zamanda Mgm101 mutant proteinleri hazırlamak için de kullanılabilir. Oligomerizasyon durumu ve Mgm101 kararlılığını sık mutasyonlar etkilenir. Hafif mutasyonlar MBP ikinci ayrışmalarının ardından, saflaştırılmış proteinlerin kısmi çökelmesine neden olabilir. Bu gibi durumlarda, 6 litre kültür hacminin artırılması boyut dışlama kromatografisinden stabil saflaştırılmış proteinlerin yeterli sünme izin verebilir. Oligomerizasyon etkileyen ciddi mutasyonlar MBP-bağlı formda protein üretimine izin verir, ancak proteinin MBP çıkarılmasından sonra stabil olmayabilir. Özet olarak, mevcut protokol E&#39;de büyük Mgm101 oligomerik halkaların yüksek seviyede ifade sağlayan güvenilir coli. Bu protokol, bu proteinlerin çözünürlüğü bakteriyel hücreler, düşük, özellikle Mgm101 ortologlar 20, 21 ve diğer oligomerik proteinlerin üretimi için adapte edilebilir.

Homolog rekombinasyon çift iplikli sonları tamiri (DSBs) ve zincirler arası çapraz bağlar, ve çökmüş çoğaltma çatal 1 DNA replikasyon reinitiation için önemlidir. Geleneksel homolog rekombinasyon, merkez reaksiyon Prokaryotlarda RecA ve RAD51 ve 1-3 ökaryotlarda Dmc1 da dahil olmak üzere, ATP-bağımlı rekombinaz tarafından katalize edilir. Bu rekombinaz dubleks DNA şablonları (Şekil 1, sol panel) 4-7 içinde homoloji arama ve iplikçik işgali başlatmak için gerekli olan ssDNA, üzerinde nükleoprotein filamentler oluştururlar. Geleneksel programına ilave olarak, aynı zamanda, bir homolog rekombinasyon RecA/Rad51-independent şekilde (Şekil 1, sağ panel) içerisinde yer alabilir. Örneğin, maya Rad52 ve Rad59 proteinler doğrudan dsDNA tatili geriden kestirmeye tarafından sunulan tamamlayıcı ssDNA ipliklerini tavlama katalize edebilir. Şarkı olarak bilinen bu rekombinasyon işlemi,le iplikçik tavlama, genellikle homolog dsDNA şablonları ile eşleştirme anlamına gelmez. Tavlama işleminden sonra, heterolog kuyrukları exonucleases ile çıkarılır ve çentikler genom süreklilik 8-10 geri ligate edilir. Tek tel çekme mekanizması ile tamir genellikle doğrudan tekrar bölgeleri arasında genom dizilerinin silinmesi eşlik eder. Rad52 bakteriyofajlar 11 arasında yaygın olan rekombinasyon proteinlerin çeşitli bir grup aittir. Bu proteinler aynı zamanda, homolog tek sarmallı DNA moleküllerinin tavlama teşvik etmedeki aktiviteleri göre, tek tel çekme Proteinleri (SSAPs) olarak bilinir. En iyi karakterize bakteriyofaj SSAPs Redβ ve laktokokkal faj ul36 gelen profajının rac ve Sak protein bakteriyofajlar λ ve P22, rect gelen Erf vardır. Benzerlik neredeyse undetect rağmen SSAPs yapısal olarak, tipik bir β-β-β-α kat ile karakterize edilirbirincil dizileri mümkün. 10 Onlar tüm form büyük homo-oligomerik halkaları - in vitro 12-14 14 kat simetri. Bu özelliği yüksek mertebeden yapısal organizasyonun fonksiyonel etkileri iyi anlaşılmış değildir. Biz mitokondriyal genom homolog rekombinasyon mekanizması anlamada ilgilendi. Daha önce, Saccharomyces cerevisiae 15 mtDNA bakımı için gerekli olan MGM101 gen tanımlanmıştır. MGM101 sonradan mitokondriyal nukleoidler ile ilişkili olduğu bulunmuştur ve DNA&#39;ya zarar veren ajanlara mtDNA tolerans 16 için gereklidir. Ancak, Mgm101 çalışma rekombinant Mgm101 üretmek için zorluk tarafından son on yılda geri gerçekleştirildi. Biz son zamanlarda E. büyük miktarlarda çözünür Mgm101 üretiminde başardı MBP-füzyon strateji kullanarak coli. Bu bize Mgm101 hisse göstermek sağladıprotein 17,18 en Rad52 aile ile biyokimyasal ve yapısal benzerlikler. Bu raporda, üç aşamalı bir saflaştırma prosedürü homojen Mgm101for biyokimyasal ve yapısal analizleri (Şekil 2) üretir, tarif edilmektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression vector pMAL-c2E</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#N8066S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission Protease</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>#27-0843-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells</td>
			<td>Strategene</td>
			<td>#230245</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11034626001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11359053001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#10837091001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#DN25-1G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11411446001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Column chromatography column</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#7372512</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#732-4130</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO)</td>
			<td>Sartorius Stedium</td>
			<td>#VS15RH02</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 prep grade column</td>
			<td>Amersham Bioscirnces</td>
			<td>#17-0489-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO)</td>
			<td>Sartorius Stedium</td>
			<td>#VS0611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of the mgm101 recombination protein by mbp-based tagging strategy

MGM101 gen mitokondriyal DNA bakım rolü için 20 yıl önce tespit edilmiştir. Çeşitli gruplardan çalışmalar Mgm101 protein mitokondriyal DNA recombinational onarım dahil olduğunu ileri sürmüşlerdir. Son araştırmalar Mgm101 Rad52 tipi rekombinasyon protein aile ile ilgili olduğunu göstermiştir. Bu proteinler, büyük oligomerik halkaları oluşturmak ve homolog tek sarmallı DNA moleküllerinin tavlama teşvik eder. Bununla birlikte, Mgm101 karakterizasyonu, rekombinant proteinin üretiminde sekteye edilmiştir. Burada, rekombinant Mgm101 hazırlanması için bir güvenilir bir yöntem tarif edilmektedir. Maltoz bağlanma proteini (MBP)-etiketli Mgm101 olanlar, Escherichia coli içinde ifade edilir. Füzyon proteini, başlangıçta amiloz afinite kromatografisi ile saflaştırılır. Proteolitik bölünme ile serbest bırakıldıktan sonra, Mgm101 katyon değişim kromatografisi ile MBP ayrılır. Monodispers Mgm101 daha sonra elde edilirboyut dışlama kromatografisi ile. Bakteri kültürü litre başına Mgm101 bir ~ 0.87 mg verim rutin elde olabilir. Rekombinant DNA Mgm101 asgari kirlenme vardır. Hazırlanan numunelerin başarıyla Mgm101 biyokimyasal, yapısal ve tek bir parçacık resim analizleri için kullanılır. Bu protokol, aynı zamanda yanlış katlanmış ve bakteri hücreleri için toksik olabilir diğer büyük oligomerik DNA bağlayıcı proteinlerin hazırlanması için kullanılabilir.

Mgm101 mitokondri bir Rad52 ilgili rekombinasyon proteindir. Rad52 yoğun mitokondriyal DNA rekombinasyon (Şekil 1) rolü için incelenmiştir. Rekombinant Mgm101 üç aşamalı bir prosedür (Şekil 2) ile hazırlanabilir. Bu Mgm101 çözünür bir biçimde ifade edilir ve daha sonra (Şekil 3) proteolitik bölünme ile etiketinden açığa çıkmasına izin veren MBP-etiketleme stratejisinin kullanımı ile kolaylaştırılır. Tipik bir preparat olarak, MBP-füzyon Mgm101 yaklaşık 2-3 mg amiloz afinite kromatografisi ile bakteriyel kültür, 1 litre elde edilebilir. Bir SDS-PAGE jeli üzerinde, MBP-Mgm101 ~ 70 kDa (Şekil 4) önemli bir grup olarak tespit edilir. Reçine uygun bir elüsyon önce yıkanır, eğer başka proteinlerin neden olduğu kirlenme ve minimaldir. PreScission Proteaz tarafından bölünme sonra, MBP ve Mgm101 sırasıyla 42 kDa ve 28 kDa bantları olarak ayrılır ve gösterilirSDS-PAGE (Şekil 5A). Eksik sindirim durumunda, bir ~ 70 kDa bandı varlığı ile belirtildiği gibi, ek PreScission Proteaz ile uzun bir sindirim tavsiye edilir. Ayrılan MBP-Mgm101 arasında katyon değişim kromatografisi için, MBP tuzunun uygulanmasından önce kolonu (Şekil 6) tarafından muhafaza edilmez. Tipik olarak, Mgm101 MBP (Şekil 5B) tarafından fark kirlenme olmadan tuzunun 500 mM ile yıkanır. 300 mM de küçük bir tepe uncleaved MBP-Mgm101 füzyon bir eser miktarda karşılık gelir, bazen görülebilir. Bu fraksiyonunda Mgm101 sütuna bağlanma yakınlığı azaltır kirletici DNA ile bağlı olması da mümkündür. Bu nedenle, katyon değişim DNA kontaminasyonu en aza indirmek için gerekli bir adımdır. Şekil 7, boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırma Mgm101 nihai aşamasını gösterir. Mgm101 oligomerler genellikle monodispers zirve Zehir~ 400 kDa. Mgm101 bazı mutant formları genellikle artan V0 arasında boyutları (boşluk hacmi) ve 400 kDa zirve ile görülür. Bunun nedeni bilinmemektedir. Mgm101 en oligomerizasyonu etkileyen mutasyonların V0 fraksiyonları Zehir agrega oluşumu neden olabilir. Ancak, monomerik Mgm101 karşılık gelen tepe görmedim. Mgm101 monomer çözeltisi içinde büyük olasılıkla kararsızdır. Arıtılmış Mgm101 ssDNA için yüksek bir bağlanma afinitesi (Şekil 8) sahiptir. SsDNA için bağlanma afinitesi jel üzerinde serbest ssDNA titrasyon dayalı tahmin edilebilir. Mgm101/ssDNA karmaşık dışarı kuyuların kötü geçirir. Olası bir açıklama, Mgm101 pozitif yüklü ve ssDNA Mgm101 için birden çok alt birimlerinin bağlayıcı elektroforez koşulları altında protein / DNA kompleksleri hareketsiz kılan negatif yük nötralize olmasıdır. Uygun bir şekilde hazırlanmış, Mgm101 ~ 200 nM&#39;lik bir Kd ile ssDNA bağlar. Şekil 9 olumsuz leke transmisyon elektron mikroskobu ile saflaştırılmış Mgm101 direkt yapısal görselleştirme gösterir. Taze hazırlanmış Mgm101 ~ 20 nm arasında bir çapa sahip büyük oligomerik halkalar esas olarak mevcuttur. Bunun yerine, yaşlı Mgm101 örnekleri sıkıştırılmış iplik oluşturur. Bu filamanlar halkaların istifleme oluşturduğu basit değildir. Filamanların bir açık desen helezonî yoktur. Filamentasyonu işlemi modüle koşullar halen araştırılmaktadır. Bu protein kalitesi 4 de inkübasyondan sonra, SDS-PAGE ile kontrol edilmesi tavsiye edilir elektron mikroskobu ile analiz edilmeden önce yaşlı örnekleri ° C. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50448/50448fig1.jpg" /> Şekil 1. Rad52 bir ca rekombinasyon sitede RAD51 recombinase ve yükleme için bir arabulucu olarak hizmet veren gösteren Basitleştirilmiş şemasınonical homolog rekombinasyon yolu (sol panel) ve RAD51 (sağ panel) bağımsız tavlama tek iplikli teşvik etmektedir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50448/50448fig3.jpg" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50448/50448fig3highres.jpg"/> Şekil 2,. Rekombinant Mgm101 hazırlanması için genel şeması. Mgm101 ilk E&#39;de ifade edilir , bir MBP-bağlı biçimde coli. Bakteriyel hücreler sonikasyon sayesinde lize edilir. DNAz Ben sindirim DNA kontaminasyonu azaltmak için uygulanır. MBP-füzyon Mgm101 daha sonra bir amiloz kolonu kullanılarak DNA-tükenmiş lizatından arıtılır. Proteolitik bölünme sonra Mgm101 serbest bırakıldığında ve katyon değişim kromatografisi ile MBP ayrılır. Bu adım, daha fazla DNA kontaminasyonunu azaltmak için gereklidir. Yıkanan Mgm101 fraksiyonu daha sonra bir Superpose 6 hazırlık dereceli kolonundan geçirerek homojenliği ile saflaştırılır. <p class="jove_content"fo: keep-together.within-page = &quot;her zaman&quot;&gt; <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50448/50448fig2.jpg" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50448/50448fig2highres.jpg"/> Şekil 3. Mgm101-ifade plazmid üretilmesinde ise pMAL-C2E-MGM101 fiziksel haritası. MBP ve Mgm101 arasındaki PreScission proteaz bölünme sitesi için belirtilir. Sırasıyla, 42 ve 28 kDa arasında bir moleküler ağırlığa sahip proteolitik bölünme verim MBP ve Mgm101. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50448/50448fig4.jpg" /> Şekil 4,. Amiloz afinite kromatografisinden sonra MBP-füzyon proteini Mgm101 saflığını gösteren SDS-PAGE. Protein konsantrasyonu, 280 nm&#39;de absorbans ölçülerek belirlenir ve Mgm101 yaklaşık 5 ug jeli üzerinde yüklenir. Jel Coomassie mavi ile boyandı. <img alt="Şekil 5," src = &quot;/ files/ftp_upload/50448/50448fig5.jpg&quot; /&gt; Şekil 5,. Mgm101 SDS-PAGE analizi. PreScission proteaz ile bölünme sonra MBP-Mgm101 füzyon protein Mgm101 A) sürümü. Proteaz O / N, sindirim sonra, proteinin yaklaşık olarak 5 ug ihtiva eden bir kısım jel üzerinde yüklenir. Jel Coomassie mavi ile lekeli. Mgm101 standart SDS-PAGE koşulları altında proteinin genel olarak pozitif yük nedeniyle 28 kDa&#39;lık beklenen büyüklüğü, biraz daha yavaş göç eder. B) Katyon değişim kromatografisi ile MBP ayrıldıktan sonra Mgm101. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/50448/50448fig6.jpg" /> Şekil 6,. Katyon değişim kromatografisi ile MBP ikinci Mgm101 ayrılmasını gösteren Kromatografi. Ayrılan MBP-Mgm101 bir Bio-Ölçek Mini Makro-Prep yüksek S kartuşu birden çok kez enjekte edilir. 5 mM bir adım tuz gradyanı, 300 mm, 500 mm, 750 mM ve NaCl 1.000 mM sonra uygulanır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50448/50448fig6large.jpg" target="_blank">larer rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/50448/50448fig7.jpg" /> Şekil 7. Kalibre edilmiş bir Superose 6 hazırlık sınıf sütun üzerinde Mgm101 oligomerlerinin elüsyon profilini gösteren Kromatogram. Kromatografi 0.5 ml / dak &#39;lık bir akış hızında gerçekleştirilir. Yıkanan Mgm101 ~ 400 kDa pik olarak görülmektedir. V0: boşluk hacmi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50448/50448fig7large.jpg" target="_blank">larer rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/50448/50448fig8.jpg" /> Şekil 8,. Saflaştınlmış Mgm101 ssDNA için güçlü bir bağlanma aktivitesi olduğunu gösteren elektroforetik mobilite kayma deneyiyle. 1.25 x 10 -3 </100 mM KCI; [γ-32P] ATP ile işaretlenmiş oligonükleotid HS40AT-F (5&#39;-TTAATATTTAATAATATAATCAATAAATAATATTATAATAATATAATATAA-3 &#39;), 20 mM Tris-HCI, pH 8.0&#39; ın ​​bağlama tamponu içerisinde belirtilen konsantrasyonlarda Mgm101 ile karıştırılır bölgesinin&gt; uM sup , 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, pH 8.0,% 10 gliserol, 1 mM DTT, 50 ug / ml BSA, ve 1 mM PMSF. 30 dakika için oda sıcaklığında kuluçkalamadan sonra, numuneler, bir% 6 yerel akrilamid jel üzerine yüklenir ve 4 ° C de 0.5X TBE tamponu Basım <img alt="Şekil 9," src="/files/ftp_upload/50448/50448fig9.jpg" /> Şekil 9. Kaldığı yapısal taze organizasyonu (sol panel) ve yaşlı (sağ panel) Mgm101 gösteren elektron mikroskobu. Negatif boyama transmisyon elektron mikroskobu 200 kV bir JEM-2100 transmisyon elektron mikroskobu (JEOL) işletim kullanılarak gerçekleştirilir. Negatif için yaşlı Mgm101 leke, proteinin 4 saklanan GF tampon ° C (20 mM MOPS, pH 7.0, 150 mM NaCI, 5 mM β-merkaptoetanol, 1 mM EDTA, pH 7.4, ve 0.2 mM PMSF) analiz edilmeden önce 4 hafta içinde. (Dr Stephan Wilkens izniyle).

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy at JoVE.com

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Maya mitokondriyal nükleoit proteini Mgm101, büyük oligomerik halkalar oluşturan bir Rad52 tipi rekombinasyon proteindir. Bir protokol, maltoz bağlanma proteini (MBP)-etiketleme katyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisi ile birlikte stratejisi kullanılarak çözülebilir rekombinant Mgm101 hazırlamak için tarif edilmektedir.

MBP tabanlı Etiketleme Stratejisi Mgm101 Rekombinasyon Protein hazırlanması

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

preparation-mgm101-recombination-protein-mbp-based-tagging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Görüntüleme.  State University of New York Upstate Medical University. Maya mitokondriyal nükleoit proteini Mgm101, büyük oligomerik halkalar oluşturan bir Rad52 tipi rekombinasyon proteindir. Bir protokol, maltoz bağlanma proteini (MBP)-etiketleme katyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisi ile birlikte stratejisi kullanılarak çözülebilir rekombinant Mgm101 hazırlamak için tarif edilmektedir.

Video: Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Predicting the Effectiveness of Population Replacement Strategy Using Mathematical Modeling

Charles Taylor and John Marshall explain the utility of mathematical modeling for evaluating the effectiveness of population replacement strategy.  Insight is given into how computational models can provide information on the population dynamics of mosquitoes and the spread of transposable elements through A. gambiae subspecies.  The ethical considerations of releasing genetically modified mosquitoes into the wild are discussed.

Charles Taylor and John Marshall explain the utility of mathematical modeling for evaluating the effectiveness of population replacement strategy. Insight is given into how computational models can provide information on the population dynamics of mosquitoes and the spread of transposable elements through A. gambiae subspecies. The ethical considerations of releasing genetically modified mosquitoes into the wild are discussed.

Matematiksel Modelleme Nüfus Yedek Strateji Etkinliği tahmin

Charles Taylor and John Marshall explain the utility of mathematical modeling for evaluating the effectiveness of population replacement strategy.  ...

Biyoloji

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Branching morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the study of branching morphogenesis. In the developing SMG, this process involves iterative steps of epithelial bud and duct formation, to ultimately give rise to a complex branched network of acini and ducts, which serve to produce and modify/transport the saliva, respectively, into the oral cavity1-3. The epithelial-associated basement membrane and aspects of the mesenchymal compartment, including the mesenchyme cells, growth factors and the extracellular matrix, produced by these cells, are critical to the branching mechanism, although how the cellular and molecular events are coordinated remains poorly understood 4. The study of the molecular mechanisms driving epithelial morphogenesis advances our understanding of developmental mechanisms and provides insight into possible regenerative medicine approaches. Such studies have been hampered due to the lack of effective methods for genetic manipulation of the salivary epithelium. Currently, adenoviral transduction represents the most effective method for targeting epithelial cells in adult glands in vivo5. However, in embryonic explants, dense mesenchyme and the basement membrane surrounding the epithelial cells impedes viral access to the epithelial cells. If the mesenchyme is removed, the epithelium can be transfected using adenoviruses, and epithelial rudiments can resume branching morphogenesis in the presence of Matrigel or laminin-1116,7. Mesenchyme-free epithelial rudiment growth also requires additional supplementation with soluble growth factors and does not fully recapitulate branching morphogenesis as it occurs in intact glands8. Here we describe a technique which facilitates adenoviral transduction of epithelial cells and culture of the transfected epithelium with associated mesenchyme. Following microdissection of the embryonic SMGs, removal of the mesenchyme, and viral infection of the epithelium with a GFP-containing adenovirus, we show that the epithelium spontaneously recombines with uninfected mesenchyme, recapitulating intact SMG glandular structure and branching morphogenesis. The genetically modified epithelial cell population can be easily monitored using standard fluorescence microscopy methods, if fluorescently-tagged adenoviral constructs are used. The tissue recombination method described here is currently the most effective and accessible method for transfection of epithelial cells with a wild-type or mutant vector within a complex 3D tissue construct that does not require generation of transgenic animals.

A technique to genetically manipulate epithelial cells within whole ex vivo cultured embryonic mouse submandibular glands (SMGs) using viral gene transfer is described. This method takes advantage of the innate ability of SMG epithelium and mesenchyme to spontaneously recombine after separation and infection of epithelial rudiments with adenoviral vectors.

Tükürük Bezi Organ Kültürleri Genetik Modifikasyon ve Rekombinasyon

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

Rastgele Microseed Matrix ELEME Protein Belirginleşmesine Başarı Oranı artırma

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are thought to play a vital role in the microtubule-dependent chromosome motions during cell division, but the relevant proteins and their exact roles are ill-defined. Thus, there is a growing need to develop assays with which to study such motility in vitro using purified components and defined biochemical milieu. Microtubules, however, are inherently unstable polymers; their switching between growth and shortening is stochastic and difficult to control. The protocols we describe here take advantage of the segmented microtubules that are made with the photoablatable stabilizing caps. Depolymerization of such segmented microtubules can be triggered with high temporal and spatial resolution, thereby assisting studies of motility at the disassembling microtubule ends. This technique can be used to carry out a quantitative analysis of the number of molecules in the fluorescently-labeled protein complexes, which move processively with dynamic microtubule ends. To optimize a signal-to-noise ratio in this and other quantitative fluorescent assays, coverslips should be treated to reduce nonspecific absorption of soluble fluorescently-labeled proteins. Detailed protocols are provided to take into account the unevenness of fluorescent illumination, and determine the intensity of a single fluorophore using equidistant Gaussian fit. Finally, we describe the use of segmented microtubules to study microtubule-dependent motions of the protein-coated microbeads, providing insights into the ability of different motor and nonmotor proteins to couple microtubule depolymerization to processive cargo motion.

Microtubules are inherently unstable polymers, and their switching between growth and shortening is stochastic and difficult to control. Here we describe protocols using segmented microtubules with photoablatable stabilizing caps. Depolymerization of segmented microtubules can be triggered with high temporal and spatial resolution, thereby assisting analysis of motions with the disassembling microtubule ends.

Sökme Mikrotubul saplı tarafından Driven Hareketleri Eğitim için Segment Mikrotübüller hazırlanması

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein subcellular localization changes; in particular, a nuclear translocation under a heat stress condition. Proteins react correspondingly to external and internal signals. A common mechanism is to change its subcellular localization. This article describes a protocol to track protein localization that does not require an antibody, radioactive labeling, or a confocal microscope. In this article, GFP is used to tag the target protein EXL-1 in C. elegans, a member of the chloride intracellular channel proteins (CLICs) family, including mammalian CLIC4. An integrated translational exl-1::gfp transgenic line (with a promoter and a full gene sequence) was created by transformation and &#947;-radiation, and stably expresses the gene and gfp. Recent research showed that upon heat stress, not oxidative stress, EXL-1::GFP accumulates in the nucleus. Overlapping the GFP signal with both the nuclei structure and the DAPI signals confirms the EXL-1 subcellular localization changes under stress. This protocol presents two different fixation methods for DAPI staining: ethanol fixation and acetone fixation. The DAPI staining protocol presented in this article is fast and efficient and preserves both the GFP signal and the protein subcellular localization changes. This method only requires a fluorescence microscope with Nomarski, a FITC filter, and a DAPI filter. It is suitable for a small laboratory setting, undergraduate student research, high school student research, and biotechnology classrooms.

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

This protocol demonstrates how to track a protein nuclear translocation under heat stress by using a green fluorescence protein (GFP) fusion protein as a marker and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. The DAPI staining protocol is fast and preserves the GFP and protein subcellular localization signals.

Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4', 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.