Bu çalışma NIH RO1 AI079253 ve Gazi İşleri Bakanlığı tarafından finanse edildi.

1. Hayvan Modelleri <ol><li> Fare: S47 phox-Kullanım / - farelerde, yaş ve cinsiyete göre eşleştirilmiş C57BL6/DBA fareler. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi deneyler için onay alın. </li><li> Anestezi: Anestezi ikna etmek için sürekli bir izofluran yönetim sistemi kullanın. Buharlaştırıcı sistemi (VetEquip) (% 2-3) izofluran ile doldurulur. Fareler dış uyaranlara yanıt olarak solunum, hareket ve korneal refleks gözlemleyerek tamamen uyuşturulduktan olduğunu onaylayın. </li><li> Cerrahi yöntemler:% 70 etanol ile cerrahi alan (benchtop) fırçalayın. Steril eldiven ve temiz bir cerrahi önlük ve maske takın. Saç kırpma ve kesik olan alanı için% 70 etanol ile dönüşümlü olarak betadin uygulayarak fareler hazırlayın. Steril bir yüzey üzerinde ameliyat gerçekleştirin ve steril aletler kullanın. Monitör fareler postoperatif kadar uyanık ve serbestçe hareket. </li><li> Intratrakeal zymosan yönetimi <ol><li> Anesteziklereolarak 1.2 nitelendirdi. </li><li> Betadin ve% 70 etanol ile cerrahi alan (boyun) Dezenfekte ve cerrahi diseksiyon ile trakea maruz. </li><li> Pierce, 27-gauge iğne ile soluk borusu ve steril PBS içinde eritildi, 0.5 ug / ml &#39;den çözeltisi (25 g fare için toplam hacim 50 ul) ile 1 ug / gr&#39; lik bir dozda zymosan (St. Louis, MO) enjekte edilir. </li><li> Kapat fareler boyun aseptik koşullarda 5-0 steril ipek dikişlerle yara. </li><li> 4 saat ve 24 saat sonra resmi. </li></ol></li><li> Çekal ligasyon ve delme <ol><li> 1.2 &#39;de tanımlanan anesteziklere. </li><li> Ameliyat bölgesinin (karın) saç Klip ve betadin ve% 70 etanol ile dezenfekte edin. </li><li> Bir orta hat laparotomi gerçekleştirin ve çekum tanımlamak. </li><li> 4-0 ipek sütür ve 21-gauge iğne tek geçişe sahip ligasyonu distal ponksiyon çekum ile maruz çekum distal 50% Arter. </li><li> 4-0 steril ipek dikişlerle kesi kapatın. </li><li> 4 saat sonra görüntü ve24 saat. </li></ol></li><li> Sözlü karbon tetraklorür (CCl4) idaresi <ol><li> 1.2 &#39;de tanımlanan anesteziklere. </li><li> Ağızdan sonda yoluyla mısır yağı içinde çözülmüş CCl4 (2 ug / g, St Louis, MO) uygulayın. CCl4 uygulama prosedür IBC / EHS ilkelerine uygun olarak belirlenmiş bir bölge içinde yapılmalıdır. </li><li> 4 saat ve 24 saat sonra resmi. </li></ol></li></ol> 2. Bir Bioluminescent Görüntü Kazanılması <ol><li> Lüminesans moduna ayarlı IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) Görüntüleme Sistemi, Initialize ve şarj bağlı cihaz (CCD) kilitlemek için sıcaklık için bekleyin. </li><li> Maruziyet süresi, binning (orta) ve F / Stop (8) ayarlarını seçin. </li><li> Normal vücut ısısını korumak için ateşli bir sahne görüntüleme odasında yatar pozisyonda yer fareler. Fareler IVIS görüntüleme odasında ise burun konisi ile 1.2 &#39;de tanımlanan anesteziklere. </li><li> L-012 yönetme<html> (20 mg / g) görüntüleme için seçilen her bir zaman noktasında retroorbital enjeksiyon yoluyla damardan steril PBS (10 mikrogram / ul) içinde eritildi. </li><li> L-012 enjeksiyonundan sonra 2 dk başlayarak görüntüler yakalayın. Biz genellikle 40 sn pozlama kullanın. </li></ol> 3. Region of Interest kullanarak Veri Analizi <ol><li> Yaşayan Image yazılımı V.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) kullanılarak veriler analiz. </li><li> Bir görüntüyü açın ve İlgi araçları Bölgesi ölçümü seçin. </li><li> Göğüs ve / veya fare fotoğrafik görüntünün üzerinde pseudo-renkli dijital görüntü (foton algılama temsilen) overlaying sonra karın üzerine Faiz şekil ve boyut Bölge seçin. </li><li> İlgi Bölgesi&#39;nden gelen sinyal yoğunluğu (foton akısı) sayısal. </li></ol> 4. Istatistik <ol><li> Bireysel zaman noktalarında Bonferroni post-test ile iki yönlü ANOVA gerçekleştirmek için istatistiksel analiz yazılım paketi kullanın. </li></ol>tle &quot;&gt; 5. Temsilcisi Sonuçlar Zymosan bir pro-inflamatuar maya hücre duvarı ürünleri ve NADPH oksidaz 3 güçlü bir aktivatörü olan. Biz daha önce bu intratrakeal zymosan daha sağlam nötrofilik akciğer inflamasyonu ve S47 phox-/ pro-enflamatuar sitokin üretimini indükler gösterdi - farelerde 1 yabani-tip ile karşılaştırıldığında. Zymosan karşılaştırmadan sonra fareler - Burada amacımız yabani-tip ve S47 phox-/ akciğerleri ROS üretimi karşılaştırmaktır. 4 saat ve 24 saatte fareler - 4 saatte zymosan intratrakeal uygulamadan sonra, bu temel hem de S47 phox-/ göre yabani-tip olarak foton emisyon bir artış ile karşılaştırıldığında, yabani-tip farelerde göğüs boyunca foton emisyon önemli bir artış gözlenmiştir. Buna karşılık, S47 phox-/ in biyolüminesans sinyalleri - farelerde zymosan tedavisi (Şekil.1 AB) sonra 4 saatte bazal seviyelerde kalmıştır. Böylece, NADPH oksidaz b görünüyorE zymosan verilmesini takiben akciğerlerde ROS üretiminin ana kaynağı. Sonra, CLP-indüklenen sepsis modelinde ROS üretimi değerlendirilmiştir. Sepsis akut akciğer hasarı (ALI) ve akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) 4, 5 gibi uç organ hasarı ile ilişkili hayatı tehdit eden bir sendromdur. ROS aracılı yaralanma sepsis kaynaklı çoklu organ disfonksiyonu sürüş önemli bir faktör olarak kabul edilmiştir. Biz ROS belirgin göğüs (4 saat) üzerinde ve başlangıca göre yabani-tip farelerden CLP takiben karın (24 saat) fazla arttığı bulunmuştur. Ancak, S47 phox-/ ROS seviyeleri - fareler zaman noktalarında (Şekil.2 AC) hem de bazal düzeyleri benzer bulunmuştur. Bu sonuçlar, CLP-indüklenmiş fare sepsis modelinde, ROS kuşak oksidaz bağımlı NADPH olduğunu göstermektedir. Son olarak, biz bir CCl 4-bağlı karaciğer hasarında modunda ROS üretimini tespit etmek bioluminescent görüntüleme kullanılırl. CCl 4 hepatosellüler nekroz neden olur ve akut karaciğer hasarı ve karaciğer fibrozisi 6 hem modellemek için kullanılır olmuştur. CCl 4 uygulamadan sonra 4 saatte fareler - iltihabı ve hasarı daha önce anlatılan modellerin aksine, biz karın ROS üretimi (yaklaşık% 35) S47 phox-/ başlangıca göre artış ılımlı olduğunu ortaya koymuştur. Fareler (Şekil 3 AB) - Ancak, 4-indüklenen ROS üretimi CCl büyüklüğünü S47 phox-/ daha yabani-tip farelerden anlamlı olarak daha fazla idi. Bu veriler hem S47 phox içeren NADPH oksidaz-bağımlı ve bağımsız ROS üretimi akut CCl 4-bağlı karaciğer hasarında meydana öneririz. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig1.jpg" /> Zymosan tedaviden sonra akciğer Şekil 1. ROS üretimini. A) Temsilcisi bioluminescenROS üretimi ce görüntüleme. Fareler ve karın ışıldama zymosan muamele ile değişmez - göğüs ek olarak, lüminesans yabani-tip ve S47 phox-/ her ikisi de karın üzerine tespit edilebilir olduğuna dikkat edin. Yabani-tip ve S47 phox-/ ve göğüs B) foton sayım - zymosan bir (BT) intratrakeal tek enjeksiyondan sonra fareler. Biyoparlaklık görüntüleme taban, 4 saat ve 24 saat sonra yapıldı. Göğüs üzerinde ilgi bölgeden Işık emisyonu belirtilen sahte renk skalası kullanılarak tespit edilmiştir. Sonuçlar ortalama olarak sunulmaktadır ± SE, n = 6-9, grup başına * = p &lt;0.05. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3925/3925fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam için tıklayınız</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3925/3925fig2.jpg" /> Şekil 2. ROS tespiti sonrasında CLP. ROS üretimi, B A) Temsilcisi biyolüminesans görüntüleme) Foton göğüs sayıları ve yabani-tip ve S47 phox-/ ve karın C) foton sayımı - başlangıçta fare, 4 saat ve CLP sonra 24 saat. Sonuçlar ortalama olarak sunulmaktadır ± SE, n = grup başına 4-5, * = p &lt;0.05. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3925/3925fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam için tıklayınız</a> . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig3.jpg" /> CCl sonrası karın 4-bağlı karaciğer hasarında Şekil 3. ROS üretimi. Oral CCl 4 tedaviden sonra başlangıçta fare, 4 saat ve 24 saat - ROS üretimi ve yabani-tip ve S47 phox-/ ve karından B) foton sayımı A) Temsilcisi biyolüminesans görüntüleme. . N = 4-5 grup başına, * = p &lt;0.05; Sonuçlar ortalama ± SE olarak sunulmuştur <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3925/3925fig3large.jpg" target="_blank">için tıklayınız büyük bir rakam</a> </a&gt;.

<ol>
	<li>Segal, B., Han, W., Bushey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+limits+innate+immune+response+in+the+lungs+in+mice.">NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice.</a> PLoS ONE. 5, e9631 (2010).</li><li>Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p47phox+mouse+knock-out+model+of+chronic+granulomatous+disease.">The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease.</a> J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).</li><li>Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+induction+of+inflammatory+responses+by+dectin-1+and+Toll-like+receptor+2.">Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2.</a> J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).</li><li>Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cecal+ligation+and+puncture:+the+gold+standard+model+for+polymicrobial+sepsis.">Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis.</a> Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).</li><li>Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septic+shock;+current+pathogenetic+concepts+from+a+clinical+perspective.">Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective.</a> Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).</li><li>Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+carbon+tetrachloride+induced+liver+fibrosis:+Histopathological+changes+and+expression+of+CD133+and+epidermal+growth+factor.">Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor.</a> BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).</li><li>Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+complement-induced+lung+injury+in+mice+with+deficiency+of+NADPH+oxidase.">Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase.</a> J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).</li><li>Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthine+oxidase+contributes+to+host+defense+against+Burkholderia+cepacia+in+the+p47(phox-/-)+mouse+model+of+chronic+granulomatous+disease.">Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease.</a> Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).</li><li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function.">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).</li><li>Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radical-free+biology+of+oxidative+stress.+American+journal+of+physiology.">Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).</li><li>Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cecal+ligation+and+puncture.">Cecal ligation and puncture.</a> Shock. 24, 52-57 .</li><li>Wardman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+and+luminescent+probes+for+measurement+of+oxidative+and+nitrosative+species+in+cells+and+tissues:+progress,+pitfalls,+and+prospects.">Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects.</a> Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).</li><li>Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+X-linked+chronic+granulomatous+disease,+an+inherited+defect+in+phagocyte+superoxide+production.">Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production.</a> Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).</li><li>Aramaki, Y., Y, ., Yoshida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+sensitive+chemiluminescence+probe,+L-012,+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells.">A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).</li><li>Daiber, A., Oelze, M., August, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+superoxide+and+peroxynitrite+in+model+systems+and+mitochondria+by+the+luminol+analogue+L-012.">Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012.</a> Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).</li><li>Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+inflammation+using+the+luminescent+probe+L-012.">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012.</a> Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Canlı hayvanlar reaktif oksijen türlerinin &quot;Gerçek zamanlı&quot; ölçümü (ROS) floresan ve kemilüminesans problar kullanılarak elde edilebilir. Floresan problar zayıf sinyal-gürültü oranı 12 olan muzdarip iken, açıklanan görüntüleme tekniği luminol tabanlı substrat L-012 ile ROS bir kimyasal reaksiyon sonrasında ışık emisyon tespiti için daha duyarlıdır. Tüm bioluminescent görüntüleme teknikleri gibi, bu metodoloji organ ve dokular tarafından dalgaboyu bağımlı ışık emilimi ve yayılımı ile sınırlıdır. Fareler - Bu deneyler yabani-tip ve S47 phox-/ ROS ölçümü için uygun deneysel koşullar oluşturulması üzerinde duruldu. Bu genetiği değiştirilmiş farelerin kullanılması ROS diğer yollar tarafından oluşturulan ROS gelen S47 phox içeren NADPH oksidaz tarafından üretilen ayırt etmemizi sağlamaktadır. S47 phox içeren fonksiyonel NADPH oksidaz olmasına rağmenROS önemli bir kaynağı, diğer NADPH oksidaz izoformlar mevcut ve ksantin oksidaz ve mitokondriyal solunum dahil olmak üzere ek ROS üreten sistemler, ROS üretebilir. NADPH oksidaz ve diğer ROS üreten yollar antimikrobiyal konak savunması ve iltihabı ve hasarı 7-10 modüle aşağı sinyal yolları üzerinde önemli ve etkileşimli etkileri olabilir. Biyolüminesans görüntüleme kullanarak, in vivo ROS üretiminin kinetiği ölçmek ve farklı inflamatuvar modelleri ROS seviyeleri NADPH oksidaz katkısı tasvir başardık. Bu yöntemin bir sınırlaması biyolüminesensin uzaysal çözünürlüğü ile ilgilidir. Biz spesifik anatomik bölümlerinde (örneğin., Toraks, abdomen) içinde lüminesans ölçebilirsiniz rağmen, organ düzeyinde lüminesans anatomik lokalize etmek zordur. Taban, 4 saat ve 24 saat: Bizim deneysel modellerin her birinde biz bioluminescent ölçümleri için 3 kez puan seçti. Bioluminescent görüntüleme analizi daha kısa aralıklarla üzerine veya in vivo ROS üretimi ve biyolüminesans yılında arasındaki ilişkinin doğrusal olup olmadığını ROS üretimi küçük farklılıkları belirlemek eğer biz bilmiyoruz. Bu sorunlar, daha fazla çalışma gerektirir. Bu çalışmalar için kullanılan modeller, biz fagositik hücreler, işe nötrofil ve makrofajlar, öncelikle fagosit NADPH oksidaz sistemi aracılığıyla ROS üretimi için sorumlu olduğunu sanıyorum. Özel hücre tiplerinin tükenmiş veya kemik kimeralar oluşturulan edildiği Gelecekteki çalışmalarda farklı hücre popülasyonu gelen ROS üretiminin göreli seviyeleri hakkında ek bilgi sağlayabilir. L-012 kullanılarak çalışmalar diğer bir olası sınırlama diğer radikaller (ROS) yanında, bazı durumlarda ROS tespiti için özgüllüğü azaltarak, bu parlak sonda ile reaksiyona olmasıdır. Zymosan enjeksiyon, S47 phox-/ ROS üretiminin eksikliği ardından - fareler NADPH oksidaz olduğunu gösterirakciğer iltihabı bu modelde ROS ana kaynağı. CLP oksidaz bağımlı NADPH vardı akciğer ve karın hem ROS sinyaller arttığı saptandı sepsis 11 ve biyolüminesans görüntüleme en yaygın hayvan modellerinde biridir. Zymosan ve CLP modellerinin tersine, ROS yabani-tip ve S47 phox-/ ikisinin karın arttı - fareler başlangıca göre, ancak yabani-tip farelerden daha büyük bir derecesi, CCl 4 S47 phox ROT üretimini uyardığını belirten etmek - NADPH oksidaz ve diğer mekanizmalar içeren. Özetle, bizim veri ROS tespiti için luminol tabanlı biyolüminesans görüntüleme yöntemi in vivo ROS üretiminin düzenlenmesi ve sonuçlarına ilişkin araştırmaları için değerli bir araç olabileceğini göstermek.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> L-012 </td><td> Wako Chemicals USA, Inc </td><td> 120-04891 </td><td></td></tr><tr><td> Zymosan </td><td> Sigma, St Louis, MO </td><td> Z4250 </td><td></td></tr><tr><td> karbon tetraklorid </td><td> Sigma, St Louis, MO </td><td> 289116 </td><td></td></tr></tbody></table>

bioluminescence imaging of nadph oxidase activity in different animal models

NADPH oksidaz antibakteriyel ve antifungal konak savunma aracılık kritik bir enzimdir. Antimikrobiyal konak savunma rolüne ek olarak, NADPH oksidaz inflamatuvar yanıt 1 modüle kritik sinyalizasyon fonksiyonları vardır. Böylece, NADPH oksidaz kökenli ROS nesil &quot;gerçek zamanlı&quot; kinetik ölçmek için bir yöntem geliştirilmesi savunma, inflamasyon ve yaralanma barındırması ilgili mekanizmalar anlamak için değerli bir araştırma aracı olması bekleniyor. Kronik granülomatöz hastalık (CGD) ciddi enfeksiyonlar ve aşırı inflamasyon ile karakterize NADPH oksidaz kalıtsal bir hastalıktır. Fagosit NADPH oksidaz aktivasyonu, kendi sitosolik alt birimden (S47 phox, phox P67, P40 ve phox) ve bir membran-sınırlayıcı flavocytochrome (bir gp91 phox ve p22 heterodimeri phox oluşur) Rac translokasyon gerektirir. KayıpCGD bu NADPH oksidaz bileşenlerin sonucu herhangi birinde işlev mutasyonlar. ÇGD olan hastalarda benzer, gp91 phox-eksik farelerde ve S47 phox-eksik farelerde arızalı fagosit NADPH oksidaz aktivitesi ve bozulmuş konak savunması 13, 14 var. Yukarıda tarif edilen NADPH oksidaz bileşenler içeren fagositler, ek olarak, diğer hücre tipleri arasında, çeşitli NADPH oksidaz izoformları değişik ifade eder. Burada yaşayan farelerde ROS üretimini ölçmek ve inflamasyon ve yaralanma modellerinde ROS nesil NADPH oksidaz katkısını belirginleştiren bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir şarj bağlı cihaz (CCD) tarafından kaydedilir ışıldama yayma L-012 (luminol bir analog) ile reaksiyona ROS dayanmaktadır. L-012 prob orijinal tanımı olarak, L-012-bağlı kemiluminesans tamamen bu reaksiyon tespit ana ROS süper olduğunu gösteren, süperoksit dismutaz kaldırılmış;oksit anyon 15. Daha sonraki çalışmalar, L-012 reaktif nitrojen türleri 16, 17 gibi diğer serbest radikaller, tespit edebildiğini göstermiştir. Kielland ve ark. 17 forbol miristat asetat, NADPH oksidaz güçlü bir aktivatörü, bu topikal uygulama ışıldayan sonda L-012 fare kullanılarak tespit edilebilir oksidaz bağımlı ROS NADPH üretim yol göstermiştir. Bu modelde, L-012-bağımlı lüminesans S47 phox-eksik farelerde kaldırılmış olduğunu gösterdi. Biz yabani-tip farelerden ve NADPH oksidaz eksikliği S47 phox-/ ROS üretimi karşılaştınl - aşağıdaki üç model fareler 2: zymosan, NADPH oksidaz aktive edebilirsiniz duvara türetilmiş ürün pro-inflamatuar fungal hücre 1) zerk; 2) çekal ligasyon ve delme (CLP), sekonder akut akciğer inflamasyonu ve hasarı ile intra-abdominal sepsis modeli ve 3) sözlü karbon tetraklorür(CCl4), ROS-bağımlı karaciğer hasarının bir model. Bu modeller özellikle sırasıyla, non-enfeksiyöz inflamasyon, polimikrobiyal sepsis ve toksin kaynaklı organ hasarının bağlamında NADPH oksidaz bağımlı ROS üretimi değerlendirmek için seçilmiştir. S47 için yabani-tip farelerde biyolüminesans karşılaştırma phox-/ - farelerde bize bu modellerde bioluminescent sinyal S47 phox içeren NADPH oksidaz tarafından üretilen ROS özgül katkıda tasvir sağlar. S47 ile karşılaştırıldığında yabani-tip farelerden artmış ROS seviyeleri gösterdi Biyoparlaklık görüntüleme sonuçları phox-/ - farelerde NADPH oksidaz enflamatuvar uyaranlara yanıt olarak ROS üretiminin ana kaynağı olduğunu belirtti. Bu yöntem, in vivo enflamasyon sırasında ROS nesil &quot;gerçek zamanlı&quot; izlenmesi için minimal invaziv bir yaklaşım sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models at JoVE.com

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

NADPH oksidaz fagositler reaktif oksijen türlerinin ana kaynağı (ROS) &#39;dir. Çünkü ROS geçici doğası nedeniyle, canlı hayvanlarda ROS seviyelerini ölçmek ve izlemek zordur. Yaşayan farelerde ROS seri ölçümü için bir minimal invaziv bir yöntem tarif edilmiştir.

Farklı Hayvan Modelleri NADPH Oksidaz Aktivitesinin Biyoparlaklık Görüntüleme

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

bioluminescence-imaging-nadph-oxidase-activity-different-animal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.2K Görüntüleme.  Vanderbilt University School of Medicine. NADPH oksidaz fagositler reaktif oksijen türlerinin ana kaynağı (ROS) 'dir. Çünkü ROS geçici doğası nedeniyle, canlı hayvanlarda ROS seviyelerini ölçmek ve izlemek zordur. Yaşayan farelerde ROS seri ölçümü için bir minimal invaziv bir yöntem tarif edilmiştir.

Video: Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized animals. Before embarking on an examination of animals for parasites, two things should be considered. One: what use will be made of the information collected, and two: which test is the most appropriate. Knowing that animals are parasitized may be something that the facility accepts, but there is often a need to treat animals and then to determine the efficacy of treatment. Parasites may be detected in animals through various techniques, including samples taken from live or euthanized animals. Historically, the tests with the greatest diagnostic sensitivity required euthanasia of the animal, although PCR has allowed high-sensitivity testing for several types of parasite. This article demonstrates procedures for the detection of endo- and ectoparasites in mice and rats. The same procedures are applicable to other rodents, although the species of parasites found will differ.

This article describes various procedures for screening rats and mice to detect endo- or ectoparasitism. Several diagnostic assays will be demonstrated, both those suitable for use on live animals and those used after euthanasia of the animal. Photographs to aid in identification of rat and mouse parasites will be included.

Tanı Laboratuvarı Sıçanlar ve Fareler Ecto-Endoparasites

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Ixodes scapularis Keneler gelen tükürük, Tükürük Bezi ve hemolimf Koleksiyonu

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

İzolasyon ve Farklı Yaşlı Fare Timik Greft Nakli.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to the frequent failure of traditional antibiotic treatments. Alternative therapeutics are urgently needed to tackle MDR bacteria.
An innovative non-antibiotic approach, antimicrobial blue light (aBL), has shown promising effectiveness against MDR infections. The mechanism of action of aBL is not yet well understood. It is commonly hypothesized that naturally occurring endogenous photosensitizing chromophores in bacteria (e.g., iron-free porphyrins, flavins, etc.) are excited by aBL, which in turn produces cytotoxic reactive oxygen species (ROS) through a photochemical process.
Unlike another light-based antimicrobial approach, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), aBL therapy does not require the involvement of an exogenous photosensitizer. All it needs to take effect is the irradiation of blue light; therefore, it is simple and inexpensive. The aBL receptors are the endogenous cellular photosensitizers in bacteria, rather than the DNA. Thus, aBL is believed to be much less genotoxic to host cells than ultraviolet-C (UVC) irradiation, which directly causes DNA damage in host cells.
In this paper, we present a protocol to assess the effectiveness of aBL therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in a mouse model of burn injury. By using an engineered bioluminescent strain, we were able to noninvasively monitor the extent of infection in real time in living animals. This technique is also an effective tool for monitoring the spatial distribution of infections in animals.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

Çok ilaca dirençli için Antimikrobiyal Mavi Işık Tedavisinin Vivo İncelenmesinin Acinetobacter baumannii Biyoparlaklık ımaging&#39;i kullanarak Enfeksiyonlar Yanık

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo fluorescence optical imaging (OI), in two different mouse models of inflammation: a rheumatoid arthritis (RA) and a contact hypersensitivity reaction (CHR) model. Light with a wavelength in the near infrared (NIR) window (650 - 950 nm) allows a deeper tissue penetration and minimal signal absorption compared to wavelengths below 650 nm. The major advantages using fluorescence OI is that it is cheap, fast and easy to implement in different animal models.
Activatable fluorescent probes are optically silent in their inactivated states, but become highly fluorescent when activated by a protease. Activated MMPs lead to tissue destruction and play an important role for disease progression in delayed-type hypersensitivity reactions (DTHRs) such as RA and CHR. Furthermore, MMPs are the key proteases for cartilage and bone degradation and are induced by macrophages, fibroblasts and chondrocytes in response to pro-inflammatory cytokines. Here we use a probe that is activated by the key MMPs like MMP-2, -3, -9 and -13 and describe an imaging protocol for near infrared fluorescence OI of MMP activity in RA and control mice 6 days after disease induction as well as in mice with acute (1x challenge) and chronic (5x challenge) CHR on the right ear compared to healthy ears.

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper explains the application of fluorescent imaging using an activatable optical imaging probe to visualize the in vivo activity of key matrix metalloproteinases in two different experimental models of inflammation.

Non-invaziv<emIn vivo</em&gt; Aktive Edilebilir Floresan Görüntüleme Ajanını Kullanan İnflamatuvar MMP Aktivitesinin Flüoresan Optik Görüntülemesi

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Cevabı İnsan İlköğretim nötrofiller ve monositler tarafından Antifungal Faaliyet Canlı Görüntüleme<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major manifestation of S. suis infections. A suitable infection model is an essential tool to understand the mechanisms of diseases caused by pathogens. Several routes of infection in mice have been developed to study the pathogenesis of S. suis infection. However, the intraperitoneal, intranasal, and intravenous routes of infection are not suitable for studying the roles of S. suis surface components in meningitis directly in the brain, such as the extracellular matrix from biofilms. Although intracisternal inoculation has been used for S. suis infection, the precise injection site has not been described. Here, the intracranial subarachnoidal route of infection was described in a mouse model to investigate the roles of biofilms in S. suis meningitis. S. suis planktonic cells or biofilm state cells were directly injected into the subarachnoid space of mice through the injection site located 3.5 mm rostral from the bregma. Histopathological analysis and increased mRNA expression of TLR2 and cytokines of the brain tissue from mice injected with biofilm state cells clearly indicated that S. suis biofilm plays definitive roles in S. suis meningitis. This route of infection has obvious advantages over other routes of infection, allowing the study of the host-bacterium interaction. Furthermore, it permits the effect of bacterial components on host immune responses directly in the brain to be assessed, and mimics bacterial entrance into the central nervous system. This route of infection can be extended for investigating the mechanisms of meningitis caused by other bacteria. In addition, it can also be used to test the efficacy of drugs against bacterial meningitis.

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Here, we describe the intracranial subarachnoidal route of infection in mice to study roles of biofilms in Streptococcus suis meningitis. This infection model is also suitable for studying the pathogenesis of other bacterial meningitis and the efficacy of new drugs against bacterial meningitis.

Kafa içi Subarachnoidal rota için soruşturma rolleri streptokok suis biyofilmler menenjit bir fare enfeksiyon modeli içinde enfeksiyon

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

Implantation and Monitoring by PET/CT of an Orthotopic Model of Human Pleural Mesothelioma in Athymic Mice

Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare and aggressive tumor arising in the mesothelium that covers the lungs, the heart, and the thoracic cavity. MPM development is mainly associated with asbestos. Treatments provide only modest survival since the median survival average is 9&#8211;18 months from the time of diagnosis. Therefore, more effective treatments must be identified. Most data describing new therapeutic targets were obtained from in vitro experiments and need to be validated in reliable in vivo preclinical models. This article describes one such reliable MPM orthotopic model obtained after injection of a human MPM cell line H2052/484 into the pleural cavity of immunodeficient athymic mice. Transplantation in the orthotopic site allows studying the progression of tumor in the natural in vivo environment. Positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) molecular imaging using the clinical [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose ([18F]FDG) radiotracer is the diagnosis method of choice for examining patients with MPM. Accordingly, [18F]FDG-PET/CT was used to longitudinally monitor the disease progression of the H2052/484 orthotopic model. This technique has a high 3R potential (Reduce the number of animals, Refine to lessen pain and discomfort, and Replace animal experimentation with alternatives) since the tumor development can be monitored non-invasively and the number of animals required could be significantly reduced.
This model displays a high development rate, a rapid tumor growth, is cost-efficient and allows for rapid clinical translation. By using this orthotopic xenograft MPM model, researchers can assess biological responses of a reliable MPM model following therapeutic interventions.

This article describes the generation of an orthotopic mouse model of human pleural mesothelioma by implantation of H2052/484 mesothelioma cells into the pleural cavity of immunocompromised athymic mice. The longitudinal monitoring of the development of intrapleural tumors was assessed by non-invasive multimodal [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography and computed tomography imaging.

Athymic Farelerde İnsan Plevral Mezotelyoma'nın Ortotopik Modelinin PET/BT ile İmplantasyonu ve İzlenmesi

Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare and aggressive tumor arising in the mesothelium that covers the lungs, the heart, and the thoracic cavity. ...