Bu yazının May 26, 2011 tarihinde vefat Dr Wenlan Wang anısına adanmıştır. Biz cömertçe Bu çalışmada kullanılan HBG3 MES hücreler sağlamak için Dr Douglas A. Kerr teşekkür ederim. Bu çalışma Nemours tarafından finanse edildi, bir Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi (NCRR) ve Merkezi desteklemek için NCRR bir Cobre hibe (5 P20 RR020173-05) INBRE program kapsamında hibe (2 RR016472-10) Çocuklar, Wilmington, Delaware, ABD için Alfred I. duPont Hastanesi Pediatrik Araştırma.

1. Adım 1: Fare Embriyonik Kök (MES) Hücre Kültürü (Zamanlama: 3 gün) 1. Kaplama birincil fare embriyonik fibroblast (PMEF) <ol><li> PMEF yapışması için jelatin ile kaplayın dört adet 100 mm doku kültürü yemekleri. Her bir çanak% 0.1 jelatin çözeltisi (StemCell Technologies) 8 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Yemeklerinden jelatin fazla çıkarın. Bulaşıkları durulama yapmayın. </li><li> Yaklaşık içeren Mitomisin C-inaktive PMEF (Millipore) bir şişe sulandırınız. 5 x 10 6 PMEF ortam 40 ml içine hücreleri (Tablo 1 &#39;de tarif bakınız) ve dört adet 100 mm&#39;lik doku kültürü plakası üzerine tabaklar. PMEF MES hücreleri için bir besleyici tabakası oluşturmak. </li><li> PMEF MES hücre kültürleri eklemeden önce en az bir gün kaplama edilmelidir. PMEF kaplama sonra 1 hafta kadar kullanılabilir. </li></ol> 2. Kaplama MES Hücreleri Motor nöronların içine MES hücre farklılaşmasının etkinliğini izlemekBiz HBG3, motor nöron özel yükseltici HB9 kontrolü altında eksprese EGFP bir transjenik fare elde edilen bir ES hücre hattı kullanılır. <ol><li> Defrost 37 ° C su banyosunda HBG3 MES hücrelerin 1 flakon (yaklaşık 1 x 10 7, Dr Douglas Kerr, Johns Hopkins Üniversitesi tarafından katkı). 15 ml tüp ES medya (Tablo 1 tarife bakınız) 5 ml ekleyin ve 5 dakika boyunca 800 rpm&#39;de hücreleri aşağı spin. </li><li> 10 ng / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyon taze olarak eklendi Lösemi inhibe edici faktör (LİF) ile ES ortam 20 ml süpernatan aspirat ve Pastör pipetiyle MES hücreleri. NOT: LİF kullanım gününde ilave edilmesi ve farklılaşmadan durumda MES hücreleri korumak için gereklidir. </li><li> Her yemekte PMEF 10 ml PMEF ortamı çıkarın ve her yemek için HBG3 ES hücre süspansiyonu 10 ml ekleyin. </li><li> 24 saat sonra kaplama, MES hücre boyutu Şekil 1B ok ile gösterilen koloni benzer küçük koloniler oluştururlar. Kaplama sonrası 72 saat, koloniboyutu es artış, çok sayıda çapı yaklaşık 100 mikron (Şekil 1B, oklarla gösterilen) olmak. Bu hücrelerin farklılaşması için hazırız. Ortam hücrelerinin proliferasyon korumak için günlük değiştirilmesi gerekir. </li></ol> 2. Adım 2: Sinir İndüksiyon (Zamanlama: 2 gün) Motor nöron içinde MES hücrelerinin farklılaşmasını teşvik etmek için, MES hücreleri PMEF ayrılmış ve bir süspansiyon bir ortamda yetiştirilir gerekir. Jelatin kaplı şişeler MES hücrelerinden PMEF ayırmak için kullanılır. <ol><li> MES koloniler nöral indüksiyon (farklılaşma gün 0 olarak tanımlanır), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 0.1 jelatin (18 ml / şişe) ile kat 2 T150 şişeler için hazır ve ardından aşırı jelatin kaldırmak ve 1x PBS üç kez yıkayın zaman. NOT: Her 100 mm çanak kültür PMEF ayırmak için bir T150-jelatin kaplı şişesi gerekir. </li><li> Dikkatle gevşek bağlı koloniler çıkarmak için değil emin, aspirasyon ortamı çıkarın. 10 ml PBS kısa eklely ve sonra yıkama adımı tamamlamak için aspirasyon kaldırın. </li><li> PMEF gelen MES hücreleri ayırmak için,% 0.25 eklemek tripsin / EDTA (3 ml / çanak, StemCell Teknolojileri) ve 37 &#39;de 3-5 dakika inkübe ° C kök hücre ve PMEF levhadan ayırmak kadar. Koloniler (15-20 kez) kırmak için aşağı LIF ve pipet hücreleri olmadan 15 ml taze ES medya ekleyin ve. Daha sonra, bir% 0.1 jelatin kaplı T150 şişesine ilave ve 37 C&#39;de 30 dakika inkübe ° C. ES hücrelerinin yüzen gerekirken inkübasyondan sonra, PMEF jelatinize yüzey eklemek gerekir. 50 ml&#39;lik bir tüp içine kayar MES hücreler toplanır. </li><li> (Tablo 1 tarife bakınız) Sinir Farklılaşma Orta 10 ml 800 rpm ve Pastör pipetiyle hücreleri aşağı Spin. </li><li> Bir 100 mm bakteriyel ya da süspansiyon kültürü çanağı üzerine bir hemasitometre ve ardından plaka yaklaşık 2 x 10 6 MES hücreleri kullanılarak hücreleri hesaplama. Bu plakalar süspansiyon kültürleri büyüme izin ve embriyoid organları (EBS) oluşumunu arttırabilir. </li><li> Differentia AçıkTION gün 1, MES hücrelerinin ışık mikroskobu altında görülebilen küçük kayan agrega (EBS) oluştururlar. Herhangi bir bulaşma, PMEF çanak eklemek. 3 dk için düşük hızda (500 rpm) 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne ve içine süspansiyon hücreleri ve medya transfer edin. Dikkatli medya aspire, yeni bir bakteriyel çanak plaka hücreleri daha sonra pelet EBS taze Sinir Farklılaşma Orta 10 ml ekleyin ve. Ortam ikmal ek olarak, bu adım adım önceden arta taşıyan herhangi bir PMEF kaldırır. </li><li> Farklılaşma Gün 2, EBS motor nöronlar indüklenen hazırdır. </li></ol> 3. Adım 3: Motor Nöron Özelliği (Zamanlama: 5 gün) <ol><li> Farklılaşma gün 2, girdap kültürü çanak ve 15 ml tüp içine medya ve EBS aktarmak Açık. EBS ağırlık (~ 10 dakika) ile ya da 3 dk için düşük hızda (500 rpm) santrifüje edilerek dinlendiriniz. </li><li> (Tarifi bkz. Motor Nöron Farklılaşma 10 ml (MSB) orta dikkatli ve Pastör pipetiyle EBS orta aspire <strong&gt; Tablo 1). Plaka yeni bir bakteriyel çanak EBS ve 5 gün boyunca günde ortamı değiştirmek. </li><li> Çapı 200 mikron ve kuvvetli GFP sinyali (Şekil 1C) ifade olmalıdır - farklılaşma 7. günde, EBS yaklaşık 150 olmalıdır. Bu EBS kaplı yemekleri veya lamelleri poly-DL-ornithine/laminin üzerine disosiye ve kaplama olmaya hazırız. </li></ol> 4. Adım 4: Poly-DL-ornithine/laminin Kaplı lameller hazırlanması (Zamanlama: 2 gün) İki gün EBS dissociating önce (farklılaşma 5. gününde yani), poly-DL-ornithine/laminin-coated lamelleri hazırlamak. <ol><li> 24-iyi plakanın altına yerleştirin 12 mm yuvarlak lamelleri (Warner Araçlar). 10X bir stok çözelti (1 mg / ml) elde etmek için 25 mg 25 ml&#39;de poli-DL-ornitin (Sigma-Aldrich), steril, çift damıtılmış su (d 2 H 2 O) içinde çözülür. Zaman kullanıma hazır, konsantrasyonlarda elde etmek için d 2 H 2 O ile poli-DL-ornitin bir 1/10 dilüsyon yapmak100 mcg / ml oranı. Gece boyunca 4 at 24-kuyulu plakalı ve inkübe her bir yanı ° C ila 0.5 ml ilave edilir. </li><li> Ertesi gün (farklılaşma günde 6), aspirat poli-DL-ornitin ve doku kültürü kaputu plakaları ve kuru kapak slipleri hava sağlar. D 2 H2O ile üç kez plakası kuyuları çalkalayın. Bir saat için hava kurumasını bekleyin. </li><li> 100X stok solüsyonu (200 ug / ml) yapmak için buzlu soğuk PBS 1X 5 ml içinde 1 mg fare laminin (Millipore) içinde çözülür. Zaman kullanıma hazır, buzlu-soğuk 1X PBS (2 mcg laminin / ml) 1/100 dilüsyon olun. 0.5 mL / 4 iyi bir 24-iyi plaka ve inkübe ° C gece için. Tohum hücreleri önce, aşırı laminin kaldırılır ve kuyular 1X PBS iki defa durulanmalıdır. Lamelleri MSB&#39;nin ortamı (0.5 ml / oyuk) saklanabilir. </li></ol> 5.. Adım 5: Axon Uzama (Zamanlama: 2 gün) <ol><li> Farklılaşma Gün 7 günü, 15 ml tüp içine EBS toplamak ve EBS (yaklaşık 3 dakika) yerleşmesine izin. Aspirat ortam ve yeniden sPBS içinde uspend EBS. EBS yerleşmek ve sonra PBS aspire izin verin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın. Hafifçe karıştırılır ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir, EBS üzere Accumax (Millipore) 1 ml ilave edilir. Sonra EBS kapsayan aşırı Accumax aspire. </li><li> EBS ayırmak için, MSB orta 3 ml ekleyin. EBS bozmak için 1 ml Eppendorf mikropipet (mavi uç) kullanarak pipet aşağı yukarı 20 kez. Oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücre süzgecinden kap (BD Falcon) ile 12x75 mm tüp için hücre süspansiyonu aktarın. Tek hücrelerin verim zenginleştirmek şekilde filtre tarafından tutulan kalan topaklar ve hücreler ile ayrışma adımda tekrar edin. Nihai tek bir hücre süspansiyonu 6 ml olacaktır. </li><li> Yavaşça bu tek hücre süspansiyonu karıştırmak ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 2x10 ml başına 5 bir hücre yoğunluğuna MND ortamı (10, her BDNF ng / ml, GDNF, CNTF ve NT-3 ile desteklenmiş) içine hücreleri ile seyreltilir. Po içeren 24 kuyucuklu plaklar hücre süspansiyonu (0.5 ml / oyuk) ekleyinly-DL-ornithine/laminin kaplamalı lamelleri (yukarıda tarif edildiği gibi, daha önce hazırlanmış). Farklılaşmış hücre kültüründe 2 gün (Şekil 1D) sonra uzun neurites uzatmak. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1A protokolünün bir taslağını göstermektedir. 1. adımda, MES hücreleri PMEF üzerinde yetiştiriliyor ve spontan farklılaşmasını önlemek için LIF ile desteklenmiş. Genel olarak, farklılaşmamış MES koloniler yuvarlak ve kompakt olup, kenarları açıkça tanımlamıştır. Koloniler birbiri ile temas halinde değildir. Tipik olarak, MES hücrelerin her 2 ~ 3 gün 1:04 oranında bölünmüş olmalıdır. Ancak, her bir hücre hattı farklı bir oranda artacak ve split oranı ampirik olarak tespit edilmelidir. Şekil 1B oklar 3 gün için bir PMEF besleyici tabakaya kültürleme sonra MES hücrelerinin tipik görünüşünü göstermektedir. Bu koloniler büyük (çapı 50-100 mikron) ama yine yuvarlak ve tanımlanmış avantajı sağlamaks. Bu aşamada koloniler farklılaşma ya da alt kültür için hazırız. Şekil 1B bir ok ucu, genellikle kaplama 24 saat sonra bulduğu küçük bir MES koloni gösterir. Kaplama dört gün sonra, MES hücreleri büyümüş olur. Onlar ayrım başlıyor belirten düzleştirilmiş bir görünüm ve tanımlanan sınırlar kaybı gösterir. Böyle hücreler, nöronal hücre içine farklılaşma için optimal değildir. Motor nöronların içine MES hücreleri ayırt etmek için, MES hücreleri EB oluşumuna izin süspansiyon koşullarda yetiştirilen gerekir. Adım 2&#39;de, ES hücreleri EB oluşumunu teşvik etmek için bir besleyici tabakası olmadan bir kültür yüzey üzerine aktarılmaktadır. Bu adımda, bunlar bir sinir soyu için doğrudan hücrelere 2 gün süreyle Noggin, bFGF ve FGF-8 ile desteklenmiş Neural Farklılaştırma besiyerinde enkübe edilir. Küçük EBS farklılaşma 1. günde mikroskop altında görülebilir. Bunlar, orta yüzen edilmelidir. Bulaşma PMEF da gün 1 adresinde bulunabilirdiferansiyasyonun ve çıkarılması gerekir. Bu hücreler EBS yeni bir bakteriyel bir çanakla pasajlanmağa çok zaman ortadan kalkar bakteriyel yemekler uygun. Böylece, farklılaşma günde 2 tarafından, az ya da hiç PMEF kültürü tabağına görülmelidir. 3. adımda, yeni yemekler için EBS transferi kalan PMEF çıkarılmasını sağlamalıdır devam etti. EBS RA ile takviye Motor Nöron Farklılaşma (MSB) medya kültürü ve motor nöronların içine hücreleri ayırt etmek için 5 gün boyunca SAG edilir. Kültür sırasında, EBS boyutları büyümeye devam ediyor ve farklılaşma 3. günde çıplak gözle görülebilir ~ 4. Şekil 1C farklılaşma 7. günde EBS mikroskobik görünüm gösterir. Farklılaşmamış hücrelerin aksine, EBS GFP ekspresyonu nedeniyle güçlü floresans gösterir. Bu EBS optimal farklılaşmış ve ayrışma için hazırız. Akış sitometrisi% 51 ± ayrışmış EBS gelen hücreler% 0.8 &#39;i ifade eden hücrelerin 5 GFP ayrışmıştır olduğunu gösterdi. Adım 5, inci kültürdeGDNF, CNTF, BDNF, ve uzun akson uzantısı projeksiyonlar NT3 sonuçlar varlığında ese motor nöron. Şekil 1B 2 gün ayrışmış EBS&#39;nin sonra kaplama farklılaşmış hücreler görünümünü gösterir. Kaplamalı hücrelerin hücre gövdeleri uzanan uzun neurites not edin. Immünofloresan boyama GFP + hücrelerin pan-nöronal marker (nörofilaman-orta zincirli) ve iki motor nöron spesifik belirteçler, (Islet-1 ve kolin asetiltransferaz, Şekil 2) ifade gösterir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig1.jpg" /> Şekil 1. Motor nöronları (resim Wu ve ark güncellenmiştir. 5) MES hücrelerin Farklılaşma. MES hücrelerinden motor nöron için farklılaşma protokolünün A) şeması. B) ayrım MES hücreler fibroblast besleyici tabakasının üstünde yuvarlak koloniler oluştururlar. Onlar zayıf GFP var. C) MES hücreleri besleyici ve katmanlar ayrıldı kültürlerdekiEBS oluşturmak için düşük eki yemekler kırmızı. Farklılaştırma prosesi ilk iki gün boyunca, hücreler 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml bFGF ve 20 ng / ml FGF-8 maruz bırakıldı. Daha sonra, onlar 1 uM retinoik asit ve 5 gün süreyle 1 uM sonik kirpi agonisti SAG ile ayırt etmek için oluşturuldu. Farklılaştırılmış MES hücreleri güçlü GFP floresan dile getirdi. D)-7 gün sonra farklılaşma, EBS poly-DL-ornithine/laminin kaplı levhalar üzerine ekildi ve ayrıştırıldı. Farklılaşmış hücre kültüründe 2 gün sonra uzun nöral süreçleri uzatıldı. Ölçek çubuğu = 200 mikron. MN = motor nöron. B, C ve D parlak bir alan görüntüler ve B &#39;, C&#39; ve D &#39;ilgili floresans görüntülerdir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig2.jpg" /> Şekil 2,. MES hücresinden türetilmiş motor nöron karakterizasyonu. Nörofilaman orta zincirli (NF-M, kırmızı), ChAT (kırmızı) ve Islet-1 (kırmızı) immünofloresan boyaması GFP (yeşil) ifade tesadüf olduession. DAPI (mavi) çekirdekleri tanımlamak için kullanılmıştır. Ölçek çubuğu = 50 um.

<ol>
	<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110, 385-397 (2002).</li><li>Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+motoneurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).</li><li>Wichterle, H., Peljto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+to+spinal+motor+neurons.">Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).</li><li>Kiris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies,+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery.">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li><li>Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+assessment+of+a+cell+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy.</a> BMC Neurosci. 12, 25 (2011).</li><li>McMahon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin-mediated+antagonism+of+BMP+signaling+is+required+for+growth+and+patterning+of+the+neural+tube+and+somite.">Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite.</a> Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).</li><li>Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+posterior+neural+tissue+is+induced+by+FGF+in+the+chick+embryo.">Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo.</a> Development. 125, 473-484 (1998).</li><li>Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+truncated+FGF+receptor+blocks+neural+induction+by+endogenous+Xenopus+inducers.">A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers.</a> Development. 122, 869-880 (1996).</li><li>Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purmorphamine+activates+the+Hedgehog+pathway+by+targeting+Smoothened.">Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened.</a> Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity.">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).</li><li>Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+FGF8+signaling+from+the+midbrain-hindbrain+junction+regulates+growth+and+polarity+in+the+developing+midbrain.">Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain.</a> Development. 124, 959-969 (1997).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

MES hücrelerinin kalitesi motor nöron verimli bir kuşak için en önemli bir parametredir. MES hücreler spontan farklılaşmasını önlemek için PMEF yetişen gerekir. LIF eklenmesi farklılaşmadan devlet MES hücrelerin korunmasına yardımcı olur. MES hücreler her 12-15 saat, bölme olarak kültür ortamı hızla tüketilmiş hale gelir ve günlük olarak değiştirilmesi gerekir. Şşş yolunun Verimli aktivasyonu motor nöron özellikleri ikna etmek için gereken kritik bir parametredir. Şşş protein (Ar-Ge Sistemi) ve bu Hh agonist HhAg1.3 (Curis, Inc), purmorphamine (Calbiochem) ve SAG (Merck) olarak Shh sinyalizasyon agonistleri tüm motor nöronların 1-3 oluşumunu teşvik etmek için kullanılmıştır , 10,11. Biz, bir motor nöron fenotipe 5 doğru hücreleri ayırmada purmorphamine göre daha etkili bir molekül olarak SAG bulundu. 1 - 1 uM RA ile 2.5 uM purmorphamine% 20&#39;den fazla bir farklılaşma verimliliği vermedim. Ancakelimizde RA 1 uM&#39;si ve SAG 1 uM&#39;si bir arada bir nöral indüksiyon adım olmadan prosedürleri yaklaşık% 25 bir farklılaşma verimliliği verdi. Daha ileri ayrıştırma verimliliğini artırmak için, önce motor nöron özellikleri adıma 2 günlük bir nöral indüksiyon adım ekleyin. Bu yaklaşım, embriyonik hücreler önce nöral lineage 6-9 girdiğinizde Noggin ve FGF sinyal hem de nöral indüksiyon erken evre için çok önemli olduğu gerçeği yararlanır. Sinir indüksiyon ek olarak, FGF sinyalleşme sinir prekürsör hücreleri gibi kültürleri korur. Gelişmekte olan beynin ortası Fgf8 aşırı ekspresyonu ventriküler zon 12 nöral prekürsör nüfusunun dramatik bir genişlemesine yol açar. FGFs ve Noggin kombinasyonu posterior nöral kimlik 9 teşvik ederek nöral doku oluşumuna sebep sinerjistik davranır. Böylece 2-günlük sinirsel indüksiyon adım doğru MES hücreleri yönlendirmek için tasarlanmıştırmotor nöron şartnamenin işlemi başlamadan önce, sinirsel soyu. Burada tanımlanan protokol daha önce tarif 1 orijinal kurulan protokolünün bir değişikliği ile geliştirilmesidir. Motor nöronların üretme zaman çizelgesi aynı olsa da, biz prosedürü hızlandırmak ve motor nöronların verimi artırmak için bir dizi değişiklikler yaptık. Farklılaşma protokolü bir sinir indüksiyon adım ekleyerek, biz% 25 den% 50 farklılaşma verimliliği artırmak edebiliyoruz. Bizim protokol MES hücrelerden köken motor nöronlar zenginleştirmek için etkin bir yaklaşım sağlar. Motor nöronların SMA hastalarında elde edilen ve SMA fareleri birincil motor nöronların kötü sağlık yeterli miktar, kalite ve bu hastalıktan etkilenen proteinlerin kantitatif analizleri yapmak için saflık hücrelerin izolasyonu engeller edilemez. Bu MES hücre protokolü kullanarak, yeterli quan bir motor nöron hücre popülasyonu elde başardıkspinal müsküler atrofi 5 etkilenen moleküler yolları belirlemek için bir proteomik çalışma için tity ve saflık.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> PMEF </td><td> Millipore </td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF orta </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-063 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> MES orta </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Hücre-Nitelikli FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16141-079 </td><td> % 15 </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Olmayan amino asitler </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Nükleosidlerin </td><td> Millipore </td><td> ES-008-D </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> LIF </td><td> Millipore </td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sinir Farklılaşma orta </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Cult FBS </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 06905 </td><td> % 15 </td></tr><tr><td> Olmayan amino asitler </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Mono-tiyo gliserol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-6145 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td> Kafa </td><td> Invitrogen </td><td> PHC1506 </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0274 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0024 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MSB orta (farklılaşma) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Cult Bazal Orta-A </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Knockout serum yerine </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> N-2 takviyesi </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> ITS Ek-B </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07155 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Askorbik asit </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07157 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td>Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> D-glukoz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 O% 0.15 </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07159 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> D 2 içinde 20 ug / ml H2O </td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td> Retinoik Asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-2625 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td> SAG </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> 566660 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MSB orta (Motor Nöron kültürü) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Cult Bazal Orta-A </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Knockout serum yerine </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> N-2 takviyesi </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> ITS Ek-B </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07155 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Askorbik asit </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07157 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> D-glukoz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 O% 0.15 </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07159 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> D 2 içinde 20 ug / ml H2O </td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr></tbody></table> NA = Non-uygulanabilir. Tablo 1. MES hücre kültürü veya farklılaşma için PMEF ve Medya. <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;reaktifin strong&gt; Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> Jelatin% 0.1 </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07903 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Poli-DL-ornitin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0421 </td><td> D 0.1 mg / ml 2 H2O </td></tr><tr><td> Fare laminin </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td><td> 2 mcg / ml PBS </td></tr><tr><td> % 0.25 tripsin / EDTA </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07901 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Millipore </td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA = Non-uygulanabilir. Tablo 2. Kaplama ve ayrışma için Reaktifler.

efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons

Fonksiyonel motor nöronların embriyonik kök (ES) hücreleri doğrudan farklılaşma, hastalık mekanizmaları incelemek için yeni ilaç bileşikleri taranması ve bu spinal müsküler atrofi (SMA) ve Amyotrofik lateral skleroz (gibi motor nöron hastalıkları için yeni tedaviler geliştirmek için bir umut kaynağı temsil ALS). Birçok mevcut protokoller motor nöronların 1-4 içine fare embriyonik kök (MES) hücreleri ayırt etmek için retinoik asit (RA) ve sonik kirpi (Sus) bir arada kullanabilirsiniz. Ancak, motor nöronların içine MES hücrelerin farklılaşması verimliliği sadece ılımlı bir başarı ile bir araya geldi. Şu anda önemli ölçüde standart prosedürlere göre farklılaşma etkinliğini arttırır iki adımlı bir farklılaşma protokolü 5 gelişmiştir. Birinci adımda Noggin ve fibroblast büyüme faktörleri (FGFs) ekleyerek neuralization işlemi arttırmaktır. Noggin bir kemik morfogenetik protein (BMP) antagonistidir ve nöral indüksiyon karışmış birnöron ve ön sinirsel desenlendirme 6 oluşumunda sonuçların varsayılan modeline ccording. FGF sinyal posterior nöral kimlik 7-9 teşvik ederek nöral doku oluşumuna sebep olarak Noggin ile sinerjik olarak hareket eder. Bu adımda, MES hücre soyları sinirsel doğru farklılaşmasını teşvik etmek için, iki gün süre ile Noggin, bFGF ve FGF-8 ile astarlanmış edildi. İkinci aşamada, motor nöron özellikleri elde edilmesini sağlanmaktadır. Noggin / MES hücreleri maruz FGFs motor nöron üretimi kolaylaştırmak için başka bir 5 gün süreyle RA ve bir Shh agonisti, düzeltilir agonisti (SAG) ile inkübe edildi. Motor nöron içinde MESS farklılaşma izlemek için, motor nöron özel yükseltici HB9 1 kontrolü altında, bir transjenik farenin ifade EGFP türetilmiş bir ES hücre dizisi kullanılabilir. Bu sağlam protokolü kullanarak, ± farklılaşma verimliliği% 0.8 51 elde (n = 3, p &lt;0.01, Student t-testi) 5. Immünofloresan elde edilen sonuçlar,boyama GFP + hücrelerin motor nöron spesifik belirteçler, Islet-1 ve asetil kolin (ChAT) olduğunu göstermiştir. Bizim iki adım farklılaşma protokolü spinal motor nöronların içine MES hücreleri ayırt etmek için etkili bir yol sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons at JoVE.com

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Biz motor nöronlar içine fare embriyonik kök hücreleri in vitro ayrımında verimliliğini artırmak için yeni bir protokol geliştirdi. Farklılaşmış ES hücreleri motor nöronlar gibi immünohistokimyasal teknikler kullanılarak nöron ve motor nöron belirleyicilerin ekspresyonu ile kanıtlandığı özellikleri satın aldı.

Motor Nöronlar içine Fare Embriyonik Kök Hücre Verimli Farklılaşma

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

efficient-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-into-motor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

22.2K Görüntüleme.  Alfred I. duPont Hospital for Children. Biz motor nöronlar içine fare embriyonik kök hücreleri in vitro ayrımında verimliliğini artırmak için yeni bir protokol geliştirdi. Farklılaşmış ES hücreleri motor nöronlar gibi immünohistokimyasal teknikler kullanılarak nöron ve motor nöron belirleyicilerin ekspresyonu ile kanıtlandığı özellikleri satın aldı.

Video: Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

İnsan Embriyonik Kök Hücre (ES) yayılması

Biyoloji

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either remain a stem cell or become another type of cell with a more specialized function, This promising of science is leading scientists to investigate the possibility of cell-based therapies to treat disease.

When culture in suspension without antidifferentiation factors, embryonic stem cells spontaneously differentiate and form three-dimensional multicellular aggregates. These cell aggregates are called embryoid bodies(EB). Hanging drop culture is a widely used EB formation induction method. The rounded bottom of hanging drop allows the aggregation of ES cells which can provide mES cells a good environment for forming EBs. The number of ES cells aggregatied in a hanging drop can be controlled by varying the number of cells in the initial cell suspension to be hung as a drop from the lid of Petri dish. Using this method we can reproducibly form homogeneous EBs from a predetermined number of ES cells. 

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

This video demonstrates how to conduct in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells to embryoid bodies using the hanging drop method.

Asma Bırak Yöntemiyle Fare Embriyonik Kök (MES) Hücreler in vitro Farklılaşma

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...