Yazarlar, bu çalışmada kullanılan bu maya nesilin erişim sağlamak için Brandon J. Zipp ve Ken B. Kaplan teşekkür etmek istiyoruz. Yazarlar ayrıca Julio Lenin Dominguez-Ramirez videoya ile yardım için teşekkür ederim. JEE NIH fon desteği hibe sayısı 5RC1GM91755 kabul eder.

1. Imalat ve montaj <ol><li> Şekil 1c gösterildiği gibi. 22,96 cm (9 &quot;) pasta pan pan tarafında yaklaşık 2 cm, siyah bir marker kalem, alüminyum heatsink işareti delikleri Not kullanma içinde alüminyum heatsink Yeri: Eğer alüminyum blok (yerel bir hurda metal dükkanı veya çevrimiçi satın <a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a> ) ön delikli gelmez, delik delinmiş ve alüminyum güvence altına almak için 1 adım önce gömme düzenlemek için ihtiyacınız olacak pasta tava blok nitrojen gaz kabarcıkları alüminyum altından kaçmasına izin için, platform ve 4 ekstra delikler blok güvence altına almak için 5 delik. </li><li> Alüminyum ısı lavabonun bulunduğu yere yakın cryo-grid kutusu yerleştirin ve çentik ve her iki tarafın işareti. </li><li> Alüminyum heatsink delikler için, # 17 matkap ucu ve # 35 cryo-Grid kutusu delikler için bir matkap ucu kullanarak her işaretli pozisyon için pilot delikler delin. </li><li> Mount 5 kullanılarak alüminyum heatsink - # 10, 1.9 cm (3 / 4 &quot;) düz kafa oluklu cıvata ve uygun somun gibi 15 - # 10 pullar iki alüminyum blok altında pullar ve arka üçüncü. Her delik Not pasta tava izleme alanı yakınında alüminyum blok Teminatsız çıkıntılar sahne görüntüleme yetenekleri sınırı titreşimler neden olabilir: Tüm montaj cıvataları iyice sıkılmış olduğundan emin olmak için kontrol edin. </li><li> Takın 3 - # 4, 0.95 cm (3 / 8 &quot;) arka cryo-ızgara kutusu montajı olarak hareket pasta tava, oluklu cıvata ve ilgili fındık yuvarlak. </li><li> 4 çubuklarını başka bir tepesinde bir Çubuk ile çiftleri birlikte Teyp. Kek tavada ters kenarlarına Şerit ayırıcılar olarak hareket etmek her çift. </li><li> Islak kek ve pasta alt ve üst yüzey GKD 2 O. ile sırasıyla tava </li><li> Sprey köpük yalıtım iki kat kek tava ile doldurun. Sonraki adıma geçmeden önce her bir katmanı Islatma. </li><li> Köpüğe pasta tava basın. </li><li> Tava baş aşağı çevirin ve ayırıcılar pasta tava başvurun kadar kek tava basın. Kek tava tepesinde herhangi bir ağırlıklı nesne yerleştirin ve tedavi etmek için bir gece bekletin. </li><li> Tırtıklı bıçak ile, aşırı kuru tava kenarından sprey köpük yalıtım kesip çubuklarını kaldırmak. </li><li> Kek pasta pan pan çıkarın. Alüminyum ısı lavabo pasta tava şimdi yalıtılmış ve &quot;kriyojenik sahne&quot; (Şekil 1a) olarak sevk edilecektir. </li><li> Kriyojenik sahne üstünden şeffaf plastik bir panoya (herhangi bir renk ve daha fazla 3 mm kalınlığında) yerleştirin. Siyah bir işaret, tek bir turda cryo-grid çapı yaklaşık 1.5 kat bir daire çizerek cryo-ızgara kutusu montaj konumu ile işaretleyin. 1.9 cm (3 / 4 &quot;) kesip delik delik gördüm. Bu panoya olarak sevk edilecektir&quot; yükleme ekranı &quot;(Şekil 1b). </li><li> Kriyojenik sahne ve objektif lensleri altında doğrudan ısı lavabo mikroskop yer tepesine yeni bir şeffaf panoya koyun. Döndürme gibi siyah bir belirteç ile hedeflerin yolunu işaretleyin. </li><li> Pano kenarından bir yarım daire çıkarmadan işaretlenen hat boyunca kesin. Bu bir yapboz veya video gösterildiği gibi delik birden çok kez gördüm 7,62 cm (3 &quot;) kullanılarak yapılabilir. </li><li> Sonunda çanağı alanı içinde yarım daire uzakta ama yine de 1.9 cm (3 / 4 &quot;) delik kesti. Seviyeleri düşer görüntüleme Bu panoya sevk edilecektir ise sıvı azot dolumu (LN 2) Bu bağlantı noktası olacak &quot;izleme ekranı&quot; (Şekil 1c). </li></ol> 2. Numune Hazırlama <ol><li> 1x10 6 hücre / mL su uygun bir konsantrasyon sentetik tam (SC) medya yetişen günlük faz maya hücreleri sulandırınız. </li><li> Seyreltilmiş maya 2 mL R2 / 1 400 örgü holey karbon kaplı bakır cryo-EM ızgara (SPI Malzemeleri, West Chester, PA) üzerine pipetlenebilir ve emilmesi için 15 saniye izin verilir. </li><li> 2 saniye için yumuşak selüloz doku yırtılmış parça (Kimwipe) ızgara arkasına dokunarak ızgara yüzeyinden uzakta aşırı sıvı Blot. </li><li> Gerekirse, ızgara, 3 su damlaları mcL (1-3 kez), ve kötü uzakta 3. adımda arka blot ile yıkanmalıdır. </li><li> Son yıkama önce, örnek pnömatik dalma dondurucu içine yüklenen ve asılı ızgara adım 2.4 gibi yıkanır. Su yüzeyinden çoğunluğu kaldırmak için yırtık kağıt mendil (Kimwipe) ızgara blot sonra, ızgara sıvı etan soğutmalı LN 2 içine daldı ve bir depolama Not 1 cryo-grid kutusuna aktarılır: önemlidir. numune nemli tutmak için, mümkün olduğunca ince sıvı bir tabaka yüzeyde bırakın. Yanlış blot ya örnek kurumasına veya elektron ışını opak buz terk edecektir. </li></ol> 3. Cryo-Işık Mikroskopi <ol><li> Kriyojenik aşaması ile doldurunLN 2 ve hızlı yükleme ekranı ile (1.9 cm (3 / 4 &quot;) tek delik ile plastik panoya) kapsar . </li><li> Metal parçası A5 açıklanan 3 vida ile monte 1.9 cm (3 / 4 &quot;) yükleme ekranında ve transfer delik içine cryo-grid transfer, LN 2 sıcaklık ulaşır. Sökün cryo-grid onun sahibinin ve iyileştirilmiş erişim için tutucu kaldırmak adım 3.10 kadar ayrı bir Dewar cryo grid sahibi LN 2 altında tutun. cryo-grid kutusu da örnek ızgara ısınmayı önlemek için LN 2 altında tutulmalıdır. </li><li> Yedek sadece alüminyum ısı lavabo üst altında kriyojenik aşamasında LN 2 Not: LN 2 düzeyleri periyodik olarak kontrol ve LN 2 ısı lavabo ile sürekli temas sağlamak için görüntüleme işlemi sırasında yenilenmeleri gerekir. Genel olarak, dolum görüntüleme ekranı dolgu bağlantı noktası üzerinden her 10 dakikada oluşur. </li><li> LN 2 Pre-serin cımbız ucu, daha sonra 1.9 cm (3 / 4 &quot;) yükleme ekranı delik kullanarak, cımbız ile alüminyum ısı lavabo düz görüntüleme yüzeye ızgara (ler) aktarmak. </li><li> Yansıyan ışık mikroskobu objektif diyafram altında dikkatlice cryo aşamalı taşımak. </li><li> Yükleme ekranı tepesinde şeffaf izleme ekranı yerleştirin. Sonra yavaş yavaş, görüntüleme ekranı Not altına kaydırarak yükleme ekranı kaldırmak: Bu noktada, örnek, en savunmasız. Mikroskop etrafında bulunan tüm hava akımları da dahil olmak üzere minimize edilmelidir: Yakın bir yerde kapı açma, insanlar geçmiş yürüyüş, solunum, vb Biz bir yüz maskesi giymiş veya bir tedbir olarak mikroskop göz mercekleri altında şeffaf bir yüz maskesi asılı öneririz. </li><li> Cryo kademeli ve düz bir ısı emici izleme alanı örnek için tarama soğuk azot gazı ortama objektif lensleri döndürün. Izgara üzerinde standart parlak bir alan ışık mikroskopi teknikleri odak merkezini bulmak ve genel bir görüntü almak için düşük bir büyütme amacı ile kullanarak. Bu deney için kullanılan ışık mikroskobu lensler ile ilgili Özellikler Deneysel Malzeme bölümünde listelenen Not: LN 2 nesnel lensler ile temas gelmez ve biz, soğutma etkilerinden görüntü veya lenslerin zarar bozulması henüz görmedik. . </li><li> Bir ilgi alanında yüksek büyütmeli Odak ve aydınlık alan, karanlık alan, polarize ışık veya floresan görüntüleme veri almak. Gelecek korelasyon düşük büyütme parlak bir alan görüntü, ilgi alanın konumunu kaydetmek için emin olun. LN 2 dolumu için yukarıda listelenen tüm önlemleri takip edilirse, daha sonra buharlaşan azot pozitif basınç görüntüleme süresi için bir kontaminasyon ortamda (oda nem bağımsız) korumak için yeterli. </li><li> Bittiği zaman, yükleme ekranında görüntüleme ekranın üst üzerinde kaydırarak değiştirin. Yükleme ekranının altında kaydırarak yavaşlatarak görüntüleme ekranı çıkarın. </li><li> Mikroskop cryo sahne çıkarın ve önceden soğutulmuş cımbız, cryo-grid kutusuna geri ızgara transfer. Çevreye karşı mühür ve LN2 Dewar sahibinin, depolama ve gelecekteki görüntüleme için transfer etmek cryo-ızgara kutusu içine cryo grid sahibi vidalayın. </li></ol> 4. Cryo-Elektron Mikroskobu <ol><li> Her zaman sıvı azot sıcaklığında numune tutarken, standart ve yerleşmiş teknikleri, bir cryo-EM transfer sahibinin örnek ızgara içine yerleştirin. </li><li> Transmisyon Elektron Mikroskobu örnek ızgara ile kriyo sahibi yerleştirin. </li><li> Uygun bir düşük büyütme (50 500x, nominal büyütme), örnek ızgara merkezinde bulabilirsiniz. </li><li> Izgara merkezi bakır sekmeleri göreli bir yönünü (Şekil 2&#39;de açıklandığı gibi) belirlemek ve korelasyon için kesin ilgi alanları belirlemek için adım 3,7 &#39;den daha önce toplanan düşük büyütme cryo-LM veri kullanın. </li><li> Mikroskop hizalama, düşük doz cryo-EM görüntüleme ve veri toplama ile devam edin. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Kriyojenik aşamada (Şekil 1a) cryo-LM cryo floresan mikroskopi ve bağlaşık cryo-LM/cryo-EM analiz için veri toplamak için etkili bir yoldur. Şekil 2, düşük ve yüksek büyütme cryo-LM görüntüleri kombinasyonu cryo-EM belirli alanlarda doğrudan referans haritalar oluşturmanıza olanak verir nasıl gösterir. Cryo-LM referans haritası (Şekil 2b), Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi tam bölgeleri bulmak için cryo-EM veri toplama sırasında kullanılmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 Kriyojenik Sahne) kriyojenik sahne düzeni monte w belirtilen bir cryo-grid transferi oluşuri. beyaz bir ok ve bir alüminyum heatsink. Izgaralar, cryo-grid kutusundan LN 2 kapsamında aktarılır ve siyah ok ile gösterildiği gibi doğrudan ısı emici görüntüleme alanına yerleştirilir. B) Görüntü yükleme ekranı ile kriyojenik sahne betimleyen . Bir liman örnekleri aktarmak ve cımbız ile ısı emici örnek izleme alanı cryo-grid örnekleri hareket c) kriyojenik olarak yükleme ekranı delik cryo-Grid kutusu montaj ve eylemleri üzerinden doğrudan yerleştirilir yerinde izleme ekranı ile objektif lensler altında pozisyon sahne. Görüntüleme ekranında özel kesme nesnel lensler kriyojenik aşamada hareket ettirmeden kolayca yerleştirin salıncak sağlar. Örnek alanın uzak görüntüleme ekranındaki delik LN 2 doldurmak gerekirse LN 2 seviyeleri doldurmak için bağlantı noktası olarak görür. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 cryo-LM bağıntılı çalışmalar için gezinme. Maya hücreleri a) Düşük büyütme cryo-LM bir örnek ızgara yapıştırılır. B) &#39;de aynı görüntü (a) bir ilgi alanı yüksek bir büyütme floresan görüntü ile kaplanmış ve dolu bir portakal çokgen ile örnek ızgara merkezi işareti. Merkezi dört ekstra bir metal sekmesini ve dördüncü açık olan meydanlar, üç bir grup oluşur. Ekstra bir metal sekmesinde üç kare, asimetrik bir merkez oluşturan kısa ve uzun eksenleri hakkında iki çift sekme paylaşın. Bu asimetrik merkez sol üst köşesinde görülebilir ve cryo-LM ve cryo-EM arasında ızgara dönme açısı ve ellilik belirtmek için kullanılır oldu. Faiz, düşük bir büyütme görüntü birçok alanda itibaren işaretlenir ve cryo-EM aynı alanları bulmak için bir referans haritası olarak kullanılır. C), (b) ilgi alanı büyütülmüş floresan cryo-LM görüntü . HTA1-CFP, c-terminal CFP histon işaretleyici, çekirdeğin konum etiketleme yeşil noktalı bir yapı olarak görülebilir. D) karşılık gelen alan cryo-EM görüntü (c) Ölçek bar, 50 mikron temsil eder . <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 cryo-LM ve cryo-EM Korelasyon aynı maya hücreleri betimleyen iki alan görüş (c, f cryo parlak alan (d), cryo-floresans (b, e) ve cryo-EM ile korele 5 mikron). Ölçek bar temsil eder.

<ol>
	<li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments.">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li><li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography:+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes.">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li><li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images.">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li><li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li><li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li><li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy.">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarının beyan ederim.

<p class="jove_content"&gt; Bizim kriyojenik sahne ve numune hazırlama teknikleri, cryo-LM ve cryo-EM arasında bağıntılı çalışmalar da dahil olmak üzere, ancak bunlarla sınırlı olmayan yaklaşımlar geleneksel oda sıcaklığı üzerinde birçok faydaları sergilerler: hızlı sabitleme<sup&gt; 1,2</sup&gt; Photobleaching azaltılmış<sup&gt; 3</sup&gt; Ve cryo-EM önce örnek bütünlüğünü tarama<sup&gt; 4,5</sup&gt; Ya da kimyasal tespiti / gömme<sup&gt; 6</sup&gt;. Cryo-EM veri toplama için darboğazlardan biri TEM örnek aktarımı ve görüntü uygun bölgelerde bulmak için ızgaranın her iki tarama için gerekli zaman. Cryo-LM hızlı veri toplama ile<sup&gt; 5</sup&gt; Zaman iyi hücreleri bulmak harcanan büyük ölçüde azaltılabilir. Böylece, hem zaman ve paradan tasarruf ve öncesi tarama ve cryo-LM ilgi alanlarının haritalanması bu darboğaz azaltmak.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Daha pahalı ya da karmaşık kriyojenik aşamalarında daha yüksek çözünürlüklü cryo-LM görüntüleme izin verebilir. Ancak, burada fabrikasyon aşamasında daha pek çok uygulama için yeterli. Cryo-LM görüntüleme ve örnek ızgara transferleri metin ve video açıklandığı gibi dikkatle yapılması halinde, tam kirlenme ücretsiz görüntüleme yapılabilir. Bu yöntem, aynı hücre, organel ya da makromoleküler kompleksi floresan ve elektron mikroskobu verileri doğrudan bir ilişki karbon destek dağınık ya da ince bir doku bölümünde içinde yer sağlar<sup&gt; 7</sup&gt;. Bu kriyojenik sahne değer bir bütün olarak ışık mikroskobu alanına cryo-LM/cryo-EM korelatif çalışmaların ötesine uzanan dikkat edilmelidir. Bu kriyojenik aşamada hassas örnekleri ve fluorofor boyalar / lekeleri için uygundur<sup&gt; 8</sup&gt; Quantum noktaları veya floresan etiketli proteinlerin<sup&gt; 9</sup&gt; Paraformaldehid glutaraldehit ve oda sıcaklığında kimyasal fiksasyon ve gömme sırasında kararsız olabilir. Sonuç olarak, biz bu kriyojenik aşamada, önce maliyet ve yetersiz erişim deterred edilmiştir cryo-LM, ilgilenenler daha yüksek erişim sağlayacağını umuyorum.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Sorun Giderme Cryo-Işık Mikroskopi</em</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 1. Örnek Adsorpsiyon:</em&gt; Farklı örnekleri karbon destek değişken adsorbsiyon özellikleri gösterebilir. Destek ızgaraları gibi sürekli karbon, holey karbon veya numune desteği için formvar kaplı ızgaraları gibi diğer türleri kullanmak gerekli olabilir. Ayrıca, örnek ızgara ve karbon yüzey bakır çubuk bağlayıcı ise, karbon yüzey kimyası, ızgara ıslatıcı ile inkübe veya parlaklık örnek ek önce boşaltma ayarlamak için gerekli olabilir.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 2. Sahne istikrar:</em&gt; Titreşim fark ederseniz, büyük olasılıkla ağırlığı yerine LN2 köpürme aşırı örnek aşamasına kaynaklanmaktadır. Kriyojenik aşamada ek bir ağırlık, bazen düşük frekanslı titreşimleri, standart 3-eksenli seyahat mikroskop sahne boyunca iletmek için neden ve bulanıklık aracılığıyla görüntüleme olumsuz etkileyebilir. Bu videoda gösterildiği gibi, mikroskop altında çift vida silah ile ayarlanabilir bir mini asansör veya ayarlanabilir bir adaptör ile seyahat aşamasında destekleyen kolayca düzeltilebilir. Her ikisi de bu ayarlanabilir destek mekanizmaları seyahat aşamasında olmayan bir hareketli kısmı ile etkileşime girer ve bu nedenle hala görüntüleme için gerekli olarak X ve Y ekseni çeviri izin verir.</p

Özel reaktifler ve ekipman Tablo: <table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Katalog # </th><th> Yorumlar </th><th> Maliyet </th></tr><tr><td> 1 - 22,86 cm (9 &quot;) eğimli kenarı ile pasta tava </td><td> İyi Cook </td><td></td><td> Yerel bakkal </td><td> 4,39 $ </td></tr><tr><td> 1 - 22,86 cm (9 &quot;) kek tava </td><td> İyi Cook </td><td></td><td> Yerel bakkal </td><td> 4,93 $ </td></tr><tr><td> Çubuklarını, 4 çift </td><td></td><td></td><td> Yerel bakkal </td><td> 0,50 $ </td></tr><tr><td> 1 - Büyük sayfalar sprey köpük </td><td> Büyük sayfalar </td><td></td><td> Yerel nalburdan </td><td> 5,98 $ </td></tr><tr><td> 1 - 4cm x8cm x1cm alüminyum blok </td><td></td><td></td><td> Yerel nalburdan veya metal hurda bahçesinde </td><td> $ 10.00 </td></tr><tr><td> 5 - # 10 1.91 cm (3 / 4 &quot;) düz başlı civatalar w / fındık oluklu </td><td></td><td></td><td> Yerel nalburdan </td><td> 0,98 $ </td></tr><tr><td> 3 - # 4: 0.95 cm (3 / 8 &quot;) Yivli cıvata w / fındık </td><td></td><td></td><td> Yerel nalburdan </td><td> 0,98 $ </td></tr><tr><td> 15 - # 10 pullar </td><td></td><td></td><td> Yerel nalburdan </td><td> 0,98 $ </td></tr><tr><td> 2 - şeffaf plastik clipboards </td><td></td><td></td><td> Yerel ofis mağaza </td><td> 6,84 $ </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM grid sahibi </td><td> Ted Pella </td><td> 160-41 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM ızgara kutusu taşıma çubuğu </td><td> Ted Pella </td><td> 160-46 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - R2 / 1 holey karbon film, 400-örgü bakır cryo-EM destek ızgara </td><td> SPI Malzemeleri </td><td> 4340C-XA </td><td></td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Deneysel malzemeleri <ol><li> Maya zorlama: Hta1-CFP: Kaplan laboratuar KanMX6: Kan (KSC-3382: Mata, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 Hta1-CFP: UC Davis). </li><li> Cryo-Işık Mikroskopi: Cryo-ışık mikroskobu görüntüleri Leica DFC310 FX CCD kamera ile Leica DM4000M yansıtan mikroskop alındı. Parlak Alan, Karanlık Alan ve Floresans görüntüleri ya HCX PL FLUOTAR 5x 0.15 NA hava amacı, bir HCX PL FLUOTAR 10x 0.30 NA hava amacı, PL FLUOTAR 50x 0.55 NA hava amacı veya NPLAN 100x 0.75 NA hava amacı ile satın alındı. Parlak Alan ve Dark Alan görüntüler, ışık kaynağı olarak 12V 100W tungsten lamba kullanılır. Filtre Küp Floresans için bir EL6000 UV lamba kaynağı Leica JC1 (BP 480/30 DM LP 505, SF BP 535/40 ve LP 580 Ex.F.) ile birlikte kullanılır. </li><li> Cryo-Transmisyon Elektron Mikroskopi: Cryo-EM görüntüler Gatan 626 cryo-devret tutucu (Gatan ABD) kullanan 200 keV bir JEM-2100-FEG Transmisyon Elektron Mikroskobu (JEOL, Japonya) işletim satın alındı. Mikroskobu, 50, 200, 1.200 ve 4.000 x 4.096 x 4.096 piksel Tietz CCD kamera (TVIPS, Gauting, Almanya) nominal büyütmelerde kaydedildi. </li></ol>

low-cost cryo-light microscopy stage fabrication for correlated light/electron microscopy

Cryo ışık mikroskobu (cryo-LM) ve kriyo-elektron mikroskobu kavrama (cryo-EM) hücresel dinamikleri ve ultrastrüktür anlamak için bir çok avantaj teşkil etmektedir. İlk olarak, hücreler her iki teknikleri için yakın bir doğal ortamda görüntülü olabilir. Vitrifikasyon süreci nedeniyle, ikinci numunelerin hızlı fiziksel immobilizasyon ziyade yavaş kimyasal sabitleme tarafından korunur. Üçüncü olarak, görüntüleme cryo-LM ve cryo-EM ile aynı örnek, &quot;temsili numuneler&quot; bir karşılaştırma yerine, tek bir hücre veri korelasyon sağlar. Bu faydalar, önceki çalışmalardan elde edilen iyi bilinen edilirken, bağlaşık cryo-LM ve cryo-EM kalır yaygın kullanımı, satın alma ya da uygun bir kriyojenik ışık mikroskobu sahne binasının gider ve karmaşıklığı nedeniyle sınırlı. Burada montaj göstermek ve yerel donanım ve bakkallarda bulunan parçalar ile 40 $ &#39;dan az herhangi bir laboratuarda imal edilebilir bir ucuz kriyojenik sahne kullanımı. Bu cryo-LM aşaması uzun çalışma mesafesi hava hedefleri ile donatılmış yansıyan ışık mikroskopları ile kullanmak için tasarlanmıştır. Bağıntılı cryo-LM ve cryo-EM çalışmaları için, biz örnek destekleyen olarak karbon kaplı standart 3 mm cryo-EM ızgaraları kullanmak uyum sağlar. Izgara örnek adsorblama sonra, örnek sırlama ve aktarma / ızgara taşınması için daha önce belirlenmiş protokoller çok tekniği görüntüleme izni için takip edilmektedir. Sonuç olarak, bu kurulum yansıyan bir ışık mikroskobu ile, herhangi bir laboratuvar dondurulmuş sulu örneklerin doğrudan bağıntılı görüntüleme erişim sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy at JoVE.com

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Biz en çok yansıyan ışık mikroskopları uyacak şekilde tasarlanmış düşük maliyetli kriyojenik sahne imalat göstermektedir. Bu laboratuvar dahili kriyojenik aşamada cryo-ışık ve cryo-elektron mikroskobu arasındaki verimli ve güvenilir bir bağlaşık görüntüleme sağlar.

Düşük Maliyetli Cryo-Işık Mikroskopi Sahne İmalatı İlişkili Işık / Elektron Mikroskopi

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

low-cost-cryo-light-microscopy-stage-fabrication-for-correlated

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K Görüntüleme.  University of California Davis. Biz en çok yansıyan ışık mikroskopları uyacak şekilde tasarlanmış düşük maliyetli kriyojenik sahne imalat göstermektedir. Bu laboratuvar dahili kriyojenik aşamada cryo-ışık ve cryo-elektron mikroskobu arasındaki verimli ve güvenilir bir bağlaşık görüntüleme sağlar.

Video: Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Biyomühendislik

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Atomik Kuvvet Mikroskopi Görüntüleme Bakteriyel İmmobilizasyon

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

Video-rate Tarama Konfokal Mikroskop ve Mikroendoskopi

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using traditional liquid injection molding processes can be an expensive process due to tooling and equipment costs. As a result, it has traditionally been impractical to use liquid injection molding for low-cost, rapid prototyping applications. We have devised a method for rapid and low-cost production of liquid elastomer injection molded devices that utilizes fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as an injection system. Low costs and rapid turnaround time in this technique lower the barrier to iteratively designing and prototyping complex elastomer devices. Furthermore, CAD models developed in this process can be later adapted for metal mold tooling design, enabling an easy transition to a traditional injection molding process. We have used this technique to manufacture intravaginal probes involving complex geometries, as well as overmolding over metal parts, using tools commonly available within an academic research laboratory. However, this technique can be easily adapted to create liquid injection molded devices for many other applications.

We have devised a method for low-cost and rapid prototyping of liquid elastomer rubber injection molded devices by using fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as a liquid injection system.

Sıvı Enjeksiyon için 3D Baskılı Kalıpları Kullanma Tıbbi Cihazlar hızlı ve düşük maliyetli Prototip

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme<em&gt; İn Vivo</em&gt; Optik Görüntüleme

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Kuantum Nokta Nanopartiküller kullanma Korelatif Işık- ve Elektron Mikroskobu

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Cryo-immobilize hücreler yapılarda bağdaşık ışık elektron izleme ve Viral Protein Imaging mikroskobu (CLEM) ilişkili

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...