Raman Boyaları ile Yüksek Oranda Çoklanmış Doku Görüntüleme

Gökkuşağı benzeri Raman boyalarının elektronik pre-rezonans uyarılmış Raman saçılması (epr-SRS) görüntülemesi, yüksek oranda çoklanmış epitop bazlı protein görüntüleme için yeni bir platformdur. Burada, antikor hazırlama, doku örneği boyama, SRS mikroskop montajı ve epr-SRS doku görüntülemeyi içeren pratik bir kılavuz sunuyoruz.

Dokulardaki spesifik biyobelirteçlerin geniş bir kapsamını görselleştirmek, karmaşık biyolojik sistemlerin karmaşık organizasyonlarını keşfetmede hayati bir rol oynar. Bu nedenle, yüksek oranda çoklanmış görüntüleme teknolojileri giderek daha fazla takdir edilmektedir. Burada, gökkuşağı benzeri Raman boyalarının elektronik pre-rezonans uyarılmış Raman saçılması (epr-SRS) görüntülemesi yoluyla standart immünofloresansla karşılaştırılabilir duyarlılığa sahip spesifik proteinlerin yüksek oranda çoklanmış titreşimsel görüntülemesinin ortaya çıkan bir platformunu tanımlamaktayız. Bu yöntem, geleneksel immünofloresansta spektral olarak çözülebilir kanalların sınırını aşar ve hücre altı çözünürlüğe sahip dokulardaki çoklu belirteçleri sorgulamak için tek atışlık bir optik yaklaşım sağlar. Genellikle paraformaldehit ile sabitlenmiş dokular, dondurulmuş dokular ve formalin sabit parafin gömülü (FFPE) insan dokuları dahil olmak üzere standart doku preparatları ile uyumludur. Bu platformun, özellikle kalın bozulmamış dokular için biyolojik örneklerin protein etkileşimlerinin daha kapsamlı bir resmini sağlayacağını öngörüyoruz. Bu protokol, antikor hazırlamadan doku örneği boyamaya, SRS mikroskop montajına, epr-SRS doku görüntülemeye kadar iş akışını sağlar.

Kompleks doku sistemleri, mekansal konumları ve etkileşim ağları işlevleri ve işlev bozuklukları ile derinden iç içe geçmiş farklı hücresel alt popülasyonlardan oluşur ^1,2. Doku mimarisini ortaya çıkarmak ve karmaşıklığını sorgulamak için, proteinlerin tek hücre çözünürlüğündeki uzamsal konumlarının bilgisi esastır. Bu nedenle, yüksek oranda çoklanmış protein görüntüleme teknolojileri giderek daha fazla takdir edilmektedir ve doku biyolojisi 3,4,5'i incelemek için bir köşe taşı haline gelebilir. Günümüzde yaygın olarak kullanılan çoklanmış protein görüntüleme yöntemleri iki ana kategoriye ayrılabilir. Bunlardan biri, çoklu doku boyama ve görüntüleme turlarına dayanan seri immünofloresan görüntüleme, diğeri ise ağır metal etiketli antikorlar 6,7,8,9,10,11,12 ile birleştirilmiş görüntüleme kütle sitometrisidir.

Burada, multipleks antikor bazlı protein görüntüleme için alternatif bir strateji tanıtılmıştır. Geniş uyarma ve emisyon spektrumları (yarı maksimumda tam genişlik (FWHM) ~500 cm-1) nedeniyle aynı anda yalnızca 4-5 kanalı görselleştirebilen yaygın floresan görüntüleme yönteminin aksine, Raman mikroskobu çok daha dar spektral çizgi genişliği (FWHM ~ 10 ^cm-1) sergiler ve bu nedenle ölçeklenebilir çokluluk sağlar. Son zamanlarda, dar spektrumdan yararlanarak, elektronik pre-rezonans uyarılmış Raman saçılma (epr-SRS) mikroskobu adı verilen yeni bir Raman mikroskobu şeması geliştirilmiştir ve çoklanmış görüntüleme için güçlü bir strateji sağlanmıştır¹³. Raman boyalarının elektronik olarak bağlanmış titreşim modlarını araştırarak, epr-SRS, Raman kesitleri üzerinde 10 13 kat ciddi bir iyileştirme etkisi elde eder ve geleneksel Raman mikroskopisinin hassasiyet darboğazının üstesinden gelir (Şekil 1A)^13,14,15. Sonuç olarak, epr-SRS'nin tespit sınırı,^{Raman'ın 13,16} hücrelerinin içindeki spesifik proteinler ve organeller gibi ilginç moleküler belirteçlerin tespit edilmesini sağlayan ^μM'nin altına itilmiştir. Özellikle, Raman boya konjuge antikorları kullanılarak, hücrelerdeki ve dokulardaki spesifik proteinlerin (immüno-eprSRS olarak adlandırılır) epr-SRS görüntülemesi, standart immünofloresansla karşılaştırılabilir duyarlılıkla gösterilmiştir (Şekil 1B)^13,17. Pompa dalga boyunu sadece 2 nm ayarlayarak, epr-SRS sinyali tamamen kapalı olacaktır (Şekil 1B), bu da yüksek titreşim kontrastını gösterir.

Prob tarafında, antikor konjugasyonu^13,18,19,20 için Manhattan Raman saçılma (MARS) boyaları adı verilen bir dizi gökkuşağı benzeri Raman probu geliştirilmiştir. Bu eşsiz Raman paleti, her biri biyoortogonal Raman spektral aralığında tek ve dar bir epr-SRS zirvesi gösteren π konjuge üçlü bağları (Ek Malzeme) taşıyan yeni boyalardan oluşur (Şekil 1C). Çekirdek kromoforun yapısını değiştirerek ve üçlü bağın her iki atomunu izotopik olarak düzenleyerek (Ek Malzeme), spektral olarak ayrılmış Raman probları geliştirilmiştir. Ölçeklenebilir çokluluktan yararlanan epr-SRS mikroskopisi, MARS boya paleti ile birleştiğinde, hücrelerde ve dokularda tek atışlık multipleks protein görüntüleme için optik bir strateji sunar.

İmmüno-eprSRS, kendine özgü güçlü yönleri olan mevcut multipleks protein görüntüleme yöntemlerine alternatif bir strateji sunmaktadır. Döngüsel boyama, görüntüleme ve sinyal giderme ile floresan yaklaşımlarıyla karşılaştırıldığında, bu Raman tabanlı platform tek yuvarlak boyama ve görüntüleme sağlar. Bu nedenle, döngüsel prosedürlerdeki pratik karmaşıklığı ortadan kaldırır ve protokolü büyük ölçüde basitleştirir, böylece çoklanmış protein görüntülemenin yeni bölgelerini açar. Örneğin, Raman boyasına özel bir doku temizleme protokolünden yararlanan immüno-eprSRS, kalın bozulmamış dokularda yüksek oranda çoklanmış protein haritalaması için üç boyuta genişletilmiştir¹⁷. 10'dan fazla protein hedefi, milimetre kalınlığındaki fare beyin dokuları boyunca görselleştirildi¹⁷. Daha yakın zamanlarda, immüno-eprSRS'nin optimize edilmiş bir biyomolekül retansiyon genleşme mikroskobu (ExM) protokolü²¹ ile bağlanması, çoklu hedeflerin tek atışlık nano ölçekli görüntülenmesi de gösterilmiştir²². Görüntüleme kütle spektroskopisi^4,9 ile karşılaştırıldığında^, epr-SRS tahribatsızdır ve kendinden optik kesitleme yeteneğine sahiptir. Ayrıca, epr-SRS doku taramasında daha zaman verimlidir. Tipik olarak, 0,5 μm piksel boyutuna sahip^{0,25 mm2'lik} bir doku bölgesinin tek bir epr-SRS kanalı için görüntülenmesi yalnızca birkaç dakika sürer. Örneğin, Şekil 4'teki dört SRS kanalı artı dört floresan kanalının toplam görüntüleme süresi yaklaşık 10 dakikadır.

Protokol, Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan hayvan deney protokolüne (AC-AABD1552) uygun olarak yürütülmüştür.

1. Raman boyası konjuge antikorların hazırlanması

1. Konjugasyon tamponunu PBS tamponunda ~0,1 M NaHCO 3 olarak hazırlayın, pH =_8,3 , 4 °C'de saklayın.
2. N-hidroksissüksinimidi (NHS) ester fonksiyonlu MARS probu (Ek Malzeme) çözeltisini susuz DMSO'da 3 mM olarak hazırlayın. MARS problarının sentezi önceki raporlara atıfta bulunabilir^13,17,18.
   NOT: Depolama amacıyla, boya NHS ester çözeltisi ışıktan korunmalı ve -20 ° C'de tutulmalıdır.
3. Antikor katıları konjugasyon tamponunda 2 mg/mL'lik bir konsantrasyonda çözün. Diğer tamponlarda çözünen antikorlar için, bunları santrifüj filtrelerle 1-2 mg / mL'lik bir konsantrasyona konjugasyon tamponuna değiştirin.
   NOT: Yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş sekonder antikorlar, türler arası reaktiviteyi en aza indirmek için multipleks boyama için tercih edilir. Kullanılan ikincil antikorlar Tablo 1 ve Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
4. Konjugasyon reaksiyonunu gerçekleştirin.
   1. İkincil antikorlar için, karıştırarak yavaşça bir cam şişedeki antikor çözeltisine 15 kat molar boya çözeltisi fazlalığı ekleyin. Örneğin, 0.5 mL 2 mg / mL antikor çözeltisine, 35 μL 3 mM boya çözeltisi ekleyin.
   2. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında (RT) 1 saat karıştırarak inkübe edin. Reaksiyonu ışıktan koruyun.
5. Arıtma.
   1. PBS tamponunda jel filtrasyon reçinesinin (Malzeme Tablosu) bulamacını, 1.5.2-1.5.4 adımlarını izleyerek hazırlayın.
   2. 50 mL'lik bir tüp içindeki 40 mL PBS tamponuna 10 mL jel filtrasyon reçine tozu ekleyin.
   3. Çözeltiyi 90 °C su banyosunda 1 saat bekletin.
   4. Süpernatantı boşaltın ve PBS'yi 40 mL'ye yeniden ekleyin. Bulamacı 4 °C'de saklayın.
   5. Boyut hariç tutma kolonunu (1 cm çap, yerçekimi akış sütunları) bulamaç çözeltisi ile 10-15 cm yüksekliğe kadar paketleyin.
   6. Reçineyi daha fazla paketlemek için kolonu ~ 10 mL PBS tamponu ile durulayın ve yıkayın.
   7. Pipet konjugasyon reaksiyonu karışımını (~ 0.5 mL) kolona dönüştürür. Tüm reaksiyon karışımı yüklendiğinde hemen elüsyon tamponu olarak 1 mL PBS tamponu ekleyin. Elüsyon arabelleğini (PBS) sütuna sürekli olarak yeniden doldurun.
   8. Kolondaki renge bakarak (MARS boyaları açık yeşilden maviye kadar renklere sahiptir) veya absorbansı 280 nm'de (A280) ölçerek eşlenik çözeltinin elüatını toplayın.
6. Toplanan çözeltiyi santrifüj filtre ile 1-2 mg/mL'ye konsantre edin.
7. Bir Nano plaka okuyucu ile konjugat çözeltinin ultraviyole görünür (UV-Vis) spektrumunu ölçerek konsantrasyonu ve ortalama etiketleme derecesini (DOL, boya-protein oranı) belirleyin.
   NOT: Ek Malzeme , hesaplama için MARS-boya NHS-esterlerinin özelliklerini sağlar. Sekonder antikor için normal DOL yaklaşık 3'tür.

2. Doku numunesi hazırlama

1. Paraformaldehit fare beyin dokularını sabitledi.
   1. Fareleri (C57BL / 6J, Dişi, 25 d doğum sonrası) izofluran ile uyuşturun. Bir ayak parmağı sıkışma testi ile uygun anesteziyi değerlendirin.
   2. Servikal yer değiştirme ile fareleri öldürün. Fareleri transkardiyal olarak PBS'de% 4 paraformaldehit (PFA) ile hemen perfüze edin.
   3. 2.1.4-2.1.5 adımlarını izleyerek fare beynini toplayın
   4. Sagital sütür boyunca beyin sapından yukarı doğru kesin. Kafatasının iki yarısını yana doğru soyun ve beyni bir cımbızla çıkarın.
   5. Toplanan beyni PBS'de% 4 PFA'da 4 ° C'de 24 saat boyunca sabitleyin. Daha sonra, fazla PFA'yı gidermek için beyni PBS tamponunda 4 ° C'de 24 saat boyunca yıkayın.
   6. Katı agarozu, gevşek bir kapakla bir beherde% 7'lik (w / v) son konsantrasyona kadar suya yerleştirin. Çözeltiyi bir cam karıştırma çubuğu ile karıştırın. Bulamacı çözelti temizlenene kadar mikrodalgada ısıtın.
   7. Agarozun 45-55 ° C'ye soğumasını bekleyin.
   8. Sıvı agarozu küçük bir odaya dökün, ardından beyni PBS'den sıvı agaroza aktarın ve beyni gömmek için bir spatula ile yönlendirin. Doku-agaroz bloğunun sertleşmesini bekleyin.
   9. Doku agrosunu bir vibratom kullanarak 40-μm kalınlığında koronal dilimlere bölün.
   10. Aşağıdaki boyama için dokuyu 4 delikli bir plakaya aktarın. Agarozu bir cımbızla çıkarın. Dokuyu üç kez 1 mL PBS ile yıkayın.
2. Dondurulmuş fare pankreas dokuları düzeltildi.
   1. Fare pankreasını PBS'de% 4 PFA'da 4 ° C'de 16-20 saat sallayarak sabitleyin.
   2. PFA'yı çıkarmak için numuneyi 1 mL PBS (4 °C) içinde üç kez yıkayın.
   3. Numuneyi (~0,3-0,5 cm boyutlarında) optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşik bloklarına gömün. Plastik bir kriyomold içine 2 damla OCT koyun. Dokuyu doğru yönde yerleştirin ve dokuların hiçbiri açıkta kalmayana kadar OCT'yi dokuların üzerine dökün.
   4. Pankreatayı 8-μm kalınlığında dilimlere ayırın ve bunları doku bağlayıcı bir cam slayt üzerine hareketsiz hale getirin, -80 ° C'de saklayın.
   5. Boyama işleminden önce, numuneyi RT'ye dengeleyin. OCT bloklarını çıkarmak için dokuyu PBS ile yıkayın.
3. FFPE örnekleri.
   1. FFPE doku kaydırağını 60 °C'de 10 dakika pişirin.
   2. Deparafinizasyon ve rehidrasyon: Numuneleri RT'de 50 mL'lik bir tüpte, her seferinde hafif sallama ile 3 dakika boyunca aşağıdaki çözeltilere sırayla yerleştirin:
      iki kez ksilen,
      iki kez etanol,
      Deiyonize suda iki kez% 95 (hacim / hacim) etanol,
      Deiyonize suda iki kez %70 (hacim/hacim) etanol,
      Deiyonize suda bir defaya mahsus %50 (hacim/hacim) etanol,
      bir kez deiyonize su.
   3. Numuneyi bir cam kavanozda 100 °C'de 20 mM sodyum sitrata (pH 8.0) aktarın. Dokuların çözeltiye batırıldığından emin olun.
   4. Kavanozu 45 dakika boyunca 60 °C'lik bir su banyosuna koyun.
   5. Numuneyi RT'de 5 dakika boyunca deiyonize suyla yıkayın.

3. Doku immüno-eprSRS boyama

1. Slayttaki doku bölümlerinin etrafına bir sınır çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın.
   NOT: Slayt boyama kavanozu, slayttaki dokunun inkübasyon adımlarını takip etmek için kullanılır. Yüzen dokular (40-μm kalınlığında fare beyin bölümleri) kuyu plakalarında boyanır.
2. Dokuları 10 dakika boyunca% 0.3-0.5 PBST (PBS'de Triton X-100) ile inkübe edin.
3. Dokuları bloke edici tamponla (PBS'de %5 eşek serumu, %0,5 Triton X-100) 30 dakika boyunca inkübe edin.
4. Birincil boyama solüsyonunu hazırlayın: Tüm birincil antikorları istenen konsantrasyonlarda 200-500 μL boyama tamponuna (PBS'de %2 eşek serumu, %0,5 Triton X-100) ekleyin. Birincil boyama solüsyonunu 5 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı sadece çökeltili formda kullanın.
5. Birincil antikor çözeltisindeki dokuyu 1-2 gün boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Slayttaki doku kesitlerini boyamak için, nemi korumak için numuneyi ıslak mendille bir boyama kutusuna koyun.
6. Slaytları RT'de her biri 5 dakika boyunca %0,3-0,5 PBST ile üç kez yıkayın. Yüzen dokular için 1 mL PBST kullanın. Slayttaki dokular için, slaytları bir slayt boyama kavanozunda yıkayın ve dokuların hepsinin çözeltiye daldırıldığından emin olun.
7. Dokuyu 30 dakika boyunca 200-500 μL bloke edici tamponda inkübe edin.
8. İkincil boyama çözeltisini hazırlayın: İstenilen konsantrasyonlarda (normalde 10 μg / mL) 200-500 μL boyama tamponuna tüm ikincil antikorları (ve gerekirse lektinleri) ekleyin. İkincil boyama solüsyonunu 5 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı sadece çökeltili formda kullanın.
9. Dokuları 1-2 gün boyunca 4 ° C'de 200-500 μL sekonder antikor çözeltisinde inkübe edin.
10. Slaytları RT'de her biri 5 dakika boyunca %0,3-0,5 PBST ile iki kez yıkayın.
11. 30 dakika boyunca 200-500 μL DAPI çözeltisi ile inkübe edin.
12. Slaytları RT'de PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
13. Yüzen doku bölümleri için, cam damlayan pipetle cam slaytlara aktarın. Dokuyu bir doku fırçası ile yayın ve gerekirse etrafı mendillerle temizleyin.
14. Dokuyu bir cam kapak kayması ile bir damla antifade reaktifine monte edin ve oje ile sabitleyin.

4. SRS mikroskop montajı

NOT: Ticari bir konfokal floresan sistemi, tandem SRS-floresan görüntülemede kullanılır. Daha fazla açıklama önceki bir rapor^17'de bulunabilir. Bu protokol, dar bant uyarımı kullanarak SRS görüntüleme tarafına odaklanacaktır.

1. Sıcaklık kontrollü bir odada titreşimden yalıtılmış bir optik masa hazırlayın.
2. Optik tablaya (Şekil 2A) senkronize bir çift lazer sistemi (pompa ve Stokes) bir chiller bağlı olarak yerleştirin.
   NOT: Çift lazer sistemindeki temel lazer, 6 ps darbe genişliği ve 80 MHz tekrarlama hızı ile 1064 nm'de bir çıkış darbe mekanizması sağlar. Stokes ışını temel lazerdendir. Stokes ışınının yoğunluğu, 8 MHz'de% 90'dan fazla modülasyon derinliğine sahip dahili bir elektro-optik genlik modülatörü (EOM) tarafından sinüzoidal olarak modüle edildi. Temel lazerin diğer kısmı, 5-6 ps darbe genişliğine sahip mod kilitli bir darbe treni üretmek için bir pikosaniye optik parametrik osilatörün (OPO) senkronize olarak tohumlanması için kullanılan 532 nm'ye frekans iki katına çıkarılır (OP'nin avara ışını interferometrik bir filtre ile bloke edilir). OPO'nun çıkış dalga boyu, pompa ışını olarak görev yapan 720-950 nm arasında ayarlanabilir.
3. Aynaları (dalga boyu aralığı: 750-1100 nm), dikroik ışın ayırıcıları (DBS, 980 nm uzun geçirgen filtre, dikdörtgen) ve lensi (akromatik, 650-1050 nm için AR kaplama) kendi montajlarına monte edin. Aynalar ve dikroik kiriş ayırıcılar için çok stabilkinematik ayna bağlantıları kullanın.
4. Lazer çıkışının yüksekliğini ve pompanın ve Stokes ışınlarının ışın boyutlarını ölçün. Işığın tüm optik elemanların merkezine çarpmasını sağlamak için aynaların ve lenslerin yüksekliğini ayarlayın.
5. M1 aynasını optik masaya yerleştirin ve lazer çıkışına ~ 45 ° yapın (Şekil 2B). Uç ve eğim ayarlamaları yapmak için kinematik montaj aparatı üzerindeki düğmeleri kullanın. Işığın masanın uzunluğu boyunca aynı yükseklikte ve masaya göre düz bir çizgide hareket ettiğinden emin olun.
6. Pompayı ve Stokes kirişlerini bölmek için dikroik ışın ayırıcıları (980 nm uzun geçirgen filtreleri) ve aynaları yerleştirin ve hizalayın (Şekil 2A-B).
7. Mercek çiftlerini (L1, L2 ve L3, L4) ışınları bir araya getirmek ve ışın çaplarını hedefin arka göz bebeğiyle eşleşecek şekilde genişletmek için ışın yollarının her birine yerleştirin ve hizalayın (Şekil 2A-B).
8. Kombine lazer ışınlarını mikroskopa hizalamak için M7 ve M8 aynalarını kullanın (Şekil 2C). Önce bir ışını mikroskopa hizalayın ve iki ışının uzamsal örtüşmesini sağlamak için diğer ışındaki ayna çiftlerini kullanın.
9. Algılama bölümünü ayarlayın.
   1. Numunelerden geçtikten sonra ileri giden pompayı ve Stokes kirişlerini toplamak için kızılötesi kaplı bir yağ kondenserine (1.4-NA) takın (Şekil 2C).
   2. BNC konektörlü korumalı bir kutuya geniş alanlı bir Si fotodiyot takın (Şekil 2E). Doygunluk eşiğini ve tepki bant genişliğini artırmak için monte edilen fotodiyota 64 V DC güç kaynağı ekleyin.
   3. İleriye dönük ışığı 2 inçlik bir aynayla yansıtın. Modüle edici Stokes ışınını engellemek için optik filtreden sonra ışığı fotodiyot üzerine yeniden odaklayın (Şekil 2D).
   4. Fotodiyotun çıkış akımını, sinyal demodülasyonu için 50 ile sonlandırılan hızlı bir kilitleme amplifikatörüne gönderin. Kilitlenebilir amplifikatöre referans sinyali olarak 8 MHz'lik bir tetikleyici gönderin.
   5. Kilitli amplifikatörün faz içi X bileşenini mikroskopun analog arayüz kutusuna gönderin.
10. Mikroskopta saf_D2O sıvısının SRS sinyalini ölçerek dahili motorlu gecikme aşaması ile zamansal örtüşmeyi optimize edin.

5. Görüntü toplama ve analizi

1. Sıralı pompa dalga boyu ayarı ile çok kanallı epr-SRS görüntüleme gerçekleştirin.
   1. Lazer kontrol panelinde lazer gücünü P_pompası = 10-40 mW ve P_Stokes = 40-80 mW olarak ayarlayın.
   2. Piksel bekleme süresini 2-4 μs olarak ayarlayın ve mikroskopi yazılımında ortalama 10-20 kare olan birden fazla kare kullanın.
      NOT: Yüksek lazer gücünün (P _pompası> 40 mW, P Stokes> 80 mW) ve küçük piksel boyutunun (<0,2 μm) kombinatoryal kullanımından kaçının, bu da muhtemelen çoklu foton uyarımı nedeniyle Raman boyalarının 'ağartma etkisine' neden olur.
   3. Kilitlenme amplifikatörünün zaman sabitlerini piksel bekleme süresinin yarısına ayarlayın.
2. Doğrusal spektral karıştırma.
   NOT: epr-SRS, tüm konsantrasyon aralığı boyunca sıkı bir doğrusal sinyal-konsantrasyon bağımlılığı izler; Bu nedenle, doğrusal spektral karıştırma, kanallar arasındaki olası çapraz konuşmaları ortadan kaldırmak için etkilidir. N MARS probları ile N-kanallı epr-SRS ölçümü için, ölçülen sinyaller (S) S = MC olarak ifade edilebilir, burada C, MARS prob konsantrasyonlarıdır ve M, MARS problarının Raman kesitleri tarafından belirlenen bir N x N matrisidir.
   1. Farklı MARS probları ile etiketlenmiş tek renkli immüno-eprSRS numuneleri üzerinde matris M'yi ölçün.
   2. C = M−1· denklemini kullanın S, çok katlı numune sinyal ölçümü S ile MARS probunun konsantrasyon matrisini belirlemek için.

Şekil 3, sabit hücreler (Şekil 3A), paraformaldehit (PFA)-sabit fare dokuları (Şekil 3B) ve formalin sabit parafin gömülü (FFPE) insan örnekleri (Şekil 3C) dahil olmak üzere farklı örneklerdeki epr-SRS'nin örnek görüntülerini göstermektedir. SRS mikroskobunun uzamsal çözünürlüğü kırınım sınırlıdır, tipik yanal çözünürlük ~ 300 nm'dir ve eksenel çözünürlük, uyarma için yakın kızılötesi ışık kullanılarak 1-2 μm'dir. Sonuç olarak, HeLa hücrelerindeki mikrotübüller gibi ince hücre altı yapılar, α-tübülinin immüno-eprSRS görüntülemesi ile sadık bir şekilde ortaya konmuştur (Şekil 3A). Ayrıca, epr-SRS genellikle klinik tanı ve patoloji araştırmaları için yaygın bir biyopsi örneği olan FFPE dokuları (Şekil 3C) ile uyumludur. İki fotonlu floresan mikroskopisine benzer şekilde, doğrusal olmayan bir süreç olarak, epr-SRS, hücre altı çözünürlükte üç boyutlu kalıpları görselleştirmek için optik bölümleme yeteneğine sahiptir (Şekil 3D-E).

İlk olarak pankreastaki Langerhans fare adacıklarının sabit dondurulmuş doku örnekleri üzerinde epr-SRS'nin multipleks protein görüntüleme yardımcı programını sergiledik. Hücre tipi sınıflandırması (β hücreleri ve β hücreler (α, δ hücreler)) ve β hücre heterojenliği ile ilişkili olduğu bilinen transkripsiyon faktörleri için hormon ekspresyonu (örneğin, insülin, glikoz agonisti (glukagon ), pankreas polipeptit (PP) ve somatostatin dahil olmak üzere çeşitli ilgili hedefler seçilmiştir²³. Floresan tespiti SRS tespitine ortogonal olduğundan, epr-SRS konfokal floresan ve iki fotonlu floresan ile tamamen uyumludur. Bir kavram kanıtı olarak, tek bir adacık üzerinde 7 renkli SRS-floresan tandem görüntüleme, iyi kontrast ve doğru desenlerle kolayca elde edildi (Şekil 4). Transkripsiyon faktörü Pdx1 gibi düşük ekspresyonlu hedefler yeterli kontrastla görüntülendi.

Ayrıca PFA ile sabitlenmiş fare beyincik dokularında sekiz renkli SRS-floresan tandem görüntüleme gösterdik (Şekil 5). Yerleşik biyobelirteçler sayesinde, serebellar granül nöronları (NeuN), Purkinje nöronları (Calbindin), astrositler (GFAP), oligodendrositler (MBP) ve GABAerjik nöronlar (GABA_B2 reseptörü) gibi farklı hücre tipleri tanımlanabilir.

Şekil 1: Yüksek oranda çoklanmış protein görüntüleme için Epr-SRS mikroskopisi . (A) Spontan Raman, rezonans olmayan SRS ve elektronik ön rezonans SRS (epr-SRS) için enerji diyagramı. Kromoforların titreşimsel geçiş hızı, epr-SRS'de 10¹³ kata kadar artırılacaktır. (B) α-tübülinin epitop bazlı immüno-görüntülemesi, ATTO740 tarafından boyanan COS-7 hücrelerinde epr-SRS tarafından yüksek titreşimsel kontrastla gösterilmiştir. Pompa lazer dalga boyu sadece 2 nm (sağda) rezonanstan uzak olduğunda epr-SRS sinyali tamamen kaybolur. Ölçek çubukları, 20 μm. (C) Ek Materyal'de listelenen NHS ester-konjuge MARS problarının Epr-SRS spektrumları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: SRS mikroskop kurulumunun tasarımı. (A) SRS kurulumunun şematik diyagramı. EOM = elektro-optik modülatör, M = ayna, L = lens, DBS = dikroik ışın ayırıcı, DM = dikroik ayna, OB = objektif lens, CO = kondenser, F = filtre, PD = fotodiyot. (B) Bu panel lazer uyarma kısmını gösterir. Lazer çıkışından gelen çift renkli ışın ilk önce her bir ışının harmanlanması ve genişletilmesi ve daha sonra birleştirilmesi ve mikroskop gövdesine yönlendirilmesi ile ayrılır. (C) Bu panel, iletilen koleksiyonu bir kondenserle gösterir. (D) Bu panel SRS algılama bölümünü gösterir. Fotodiyot ve filtre, iki BNC dişi konektörlü korumalı kutuya monte edilir. Daha düşük BNC konektörü ters sapma voltajı içindir ve daha yüksek BNC konektörü, 50 Ω ile sonlandırılan kilitleme amplifikatörüne akım sinyali çıkışı içindir. (E) Bu panel, Si fotodiyotunun korumalı kutunun içine nasıl monte edildiğini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Farklı protein belirteçlerinin immünoetiketleme yoluyla Raman boya görüntülemesi. (A) HeLa hücrelerinde α-tübülinin immüno-eprSRS görüntülemesi. (B) PFA sabit fare beyin korteksinde NeuN'nin immüno-eprSRS görüntülemesi. (C) Vimentin'in insan böbrek FFPE dokusunda immüno-eprSRS görüntülemesi. (D) MARS2145'in 100 μm kalınlığındaki fare beyin dokusunda boyanmış GFAP'nin hacimsel olarak işlenmiş görüntüsü. Z'deki adım boyutu 2 μm idi. (E) MARS2228'in hacimsel olarak işlenmiş görüntüsü, 40-μm kalınlığındaki fare beyin dokusunda NeuN'yi boyadı. Z'deki adım boyutu 1 μm idi. Ölçek çubukları, 20 μm in (A), 50 μm in (B-C), 30 μm in (D-E). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Dondurulmuş fare adacık dokusunda hormonların ve transkripsiyon faktörlerinin 7 renkli tandem görüntülenmesinin temsili sonuçları. Epr-SRS: İnsülin (Cy5, β hücreli belirteç, yeşil ile tespit edilir), Pdx1 (MARS2228 tarafından tespit edilir, transkripsiyon faktörü, kırmızı), Glukagon (MARS2216 tarafından tespit edilir, α hücreli belirteç, sarı), PP (MARS2147 tarafından algılanır, PP hücre işaretleyicisi, mavi). Floresan: Somatostatin (Alexa488, δ hücreli işaretleyici, turuncu), Nkx2.2 (Cy3, transkripsiyon faktörü, macenta), DAPI (çekirdek, koyu mavi). Ölçek çubuğu, 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: PFA sabit fare beyin kesitinde hücre tipi belirteçlerin 8 renkli tandem görüntülemesinin temsili sonuçları. Floresan: DNA (DAPI), GABA (γ-aminobütirik asit) B reseptörü 2 (GABAerjik nöronlar, Alexa Fluor 488), nöronal çekirdekler (NeuN; nöronlar, Alexa Fluor 568) ve Calbindin (Purkinje nöronları, Alexa Fluor 647); epr-SRS: buğday tohumu aglütininin (WGA; MARS2228), Vimentin (MARS2200), miyelin bazik proteini (MBP; oligodendrositler, MARS2176) ve GFAP (astrositler ve nöral kök hücreler, MARS2145). Ölçek çubuğu, 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: İmmüno-eprSRS için doğrulanmış antikorlar. Daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosu'na bakın. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Materyal: Kullanılan 8 NHS-ester-işlevselleştirilmiş MARS probunun özellikleri. MARS_{boyalarının λ abs} ve uyarma katsayıları, kap olarak 1 cm'lik cam küvet kullanılarak UV-Vis spektrometresindeki DMSO çözeltisinde ölçülmüştür. MARS boyalarının mutlak Raman kesitleri, DMSO'da MARS boyalarının epr-SRS sinyalini metanolün standart C-O streç modu (1030 ^cm-1) ile karşılaştırarak belirlendi. Metanolün standart C-O germe modu (1030 cm-1) için mutlak Raman kesiti, 785 nm'de 2.1 x ^{10-30 cm2} olarak bildirilmiştir. Ekstrapolasyon ile 860 nm pompa dalga boyu altında ^{0.9 x 10-30 cm2'lik} bir kesit tahmin edilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Burada, taze korunmuş fare dokuları, FFPE insan dokuları ve dondurulmuş fare dokuları dahil olmak üzere yaygın doku tiplerine geniş çapta uygulanabilir olan immüno-eprSRS protokolünü sunuyoruz. İmmüno-eprSRS, Tablo 1'de listelendiği gibi, hücrelerdeki ve dokulardaki epitoplardan oluşan bir panel için doğrulanmıştır. Bu tek atışlık platform, döngüsel stratejilerin iyi çalışmadığı uygulamalar için özellikle uygundur. Örneğin, döngüsel floresan kalın dokular için talep ediyor, çünkü 3D immünoetiketlemenin çoklu turları pratik olmayan uzun¹⁷. Ayrıca, doğrusal olmayan 3B histolojik değişiklikler^11,17 nedeniyle kayıt hataları getirme olasılığı da yüksektir. İmmüno-eprSRS, böyle bir senaryoda döngüsel floresanın pratik engellerinin üstesinden gelir ve büyük bir hacim^17'de protein etkileşim ağlarını ortaya çıkarma fırsatları sunar.

Mevcut multipleksite esas olarak ikincil antikorların mevcudiyeti ile sınırlıdır. Bu protokolde, MARS problarının sekonder antikorlara konjuge edildiği, doğrudan immünoetiketleme ve lektin boyamasının mümkün olduğu dolaylı immünoetiketlemeye odaklandık¹⁷. Raman boyaları ile daha fazla primer antikor validasyonundan sonra, şu anda geliştirilmiş Raman boyaları^13,18,24 ile ²⁰ kanal beklenmektedir. Dahası, çok düşük bol miktarda hedeflerin görüntülenmesi, konfokal floresan sistemine kıyasla biraz tehlikeye giren hassasiyeti nedeniyle epr-SRS için zor olabilir. Bu bağlamda, daha parlak MARS boyalarına nispeten düşük bol miktarda hedefler ve floresan kanallarına düşük ekspresyonlu hedefler atamanızı öneririz.

Protokolün kritik bir yönü, aletlerin ve probların erişilebilirliğidir. Enstrümantasyon açısından, bir SRS mikroskobu genellikle bir optik modülatör, bir mikroskop, bir fotodiyot dedektörü ve demodülasyon²⁵ için bir kilitleme amplifikatörü ile çift renkli bir lazer kaynağından oluşur. Her bileşen, iki fotonlu lazer taramalı floresan mikroskobundan biraz daha yüksek bir toplam maliyetle ticari olarak temin edilebilir. Tamamen entegre bir multimodal SRS / floresan araştırma mikroskobu, SRS uyarma ve floresan için sürekli dalga (CW) lazer setleri için burada olduğu gibi benzer bir pikosaniye lazer kullanılarak²⁶ ticarileştirilmiştir. Bu sistem, günlük biyolojik araştırmalarda multipleks titreşimli görüntüleme için kolayca uygulanabilir. Prob açısından, MARS probları henüz ticarileştirilmemiştir ve bazı sentez yetenekleri gerektirir. Alternatif olarak, birçok ticari uzak kırmızı florofor (L. Wei et al. Nature 2017^13'teki Genişletilmiş Veri Tablo 1'e bakınız) epr-SRS için kullanılabilir. Yine de, çokluluk tehlikeye girebilir. Dahası, MARS probları doğası gereği küçük organik moleküller olduğundan, immüno-eprSRS doku boyama açısından immünofloresana benzer. Bu nedenle, immünofloresandaki antikorlar gibi doğrulanmış afinite reaktiflerinin arşivi, immüno-eprSRS uygulamalarına kolayca aktarılabilir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Ruth A. Singer ve Richard K.P. Benninger'e fare pankreas dokuları sağladıkları için teşekkür ederiz. W.M., NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) ve ABD Ordusu'nun (W911NF-19-1-0214) desteğini kabul etmektedir.