Fare İlköğretim Hepatositlerde Yağ Asidi Oksidasyon ve lipogenez Belirlenmesi

De novo lipogenez ve β-yağ asidi oksidasyon hepatosit kilit metabolik, yağlı karaciğer hastalığı da dahil olmak üzere birçok metabolik bozukluklar, içinde tedirgin olan yollar oluşturmaktadır. Burada fare primer hepatositlerin izolasyonu göstermek ve β-yağ asidi oksidasyon ve lipogenez ölçümü açıklar.

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.

In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via β-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling.

Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

Non-alcoholic fatty liver disease is one of the leading causes of liver disease in Westernized cultures^1,2. Lipid accumulation within the liver is associated with cell death, fibrosis, and liver failure via yet unknown mechanisms^3-6. In fatty liver disease, hepatocyte-mediated β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis are important determinants of net lipid accumulation^7,8. This article will, therefore, focus on hepatocyte isolation, followed by quantification of β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis.

Numerous methodologies have been developed to interrogate hepatocyte lipid metabolism. Though it is possible to measure metabolism of fat in vivo using stable isotopes^9,10, these methods are costly, and require large numbers of animals. Additionally, the ability to investigate the effect of exogenous chemicals is limited due to the nature of in vivo experimentation. In contrast, the isolation of primary hepatocytes from mouse liver provides an affordable avenue to pursue¹¹. Furthermore, studying hepatocytes in culture allows investigators to study the effects of varying chemicals on lipid processing while circumventing the difficulties of in vivo experimentation. Finally, isolated hepatocytes avoid any confounding from varying genetics since they are derived from the liver of a single animal.

Here we isolate and culture of hepatocytes, and we measure β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled palmitate. The protocol detailed below is straight forward, effective, and reproducible.

Tüm hayvan deneyleri yerel ve federal düzenlemelere uygun ve kurumsal IACUC ve radyasyon güvenliği yönetiminin onayı ile yapılmalıdır.

1. Hazırlık

1. Birkaç gün önce tahlil için, Karaciğer Digest Medium (LDM) 500 ml şişe çözülme ve 50 ml konik tüpler içinde ~ 35 ml alikotları dondurursam. Kadar gerekli -20 ° C'de saklayın.
2. Bir gün önce tahlil için, otoklav ile temiz diseksiyon araçları önceden sterilize edin.
3. Analiz gününde, kollajen ile 24 oyuklu kültür plakaları gerekli miktarda muamele.
   1. PBS ile 50 kısım, 3 mg / ml fare kuyruk kolajeni 1 kısım karıştırın. Bir 24-yuvalı plakanın her oyuğuna yaklaşık 500 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca (RT) enkübe edilir. Kollajen çıkarın ve plaka kaput kuru hava için izin verir. En az bir ek tekrarlayın.
      Not: Kollajen kaplama reklamda bir haftaya kadar yapılabilirvance ve plakalar plastik sargı mühürlü 4 ° C'de saklandı.
4. 37 ° C'ye kadar çözülme LDM ve sıcak ve 1 N KOH kullanılarak 7.4'e pH ayarlamak: deney için LDM hazırlayın. Bir çevrimli 42 ° C su banyosunda 0.2 mikron şırınga filtresi ve yer kullanarak Filtre.
5. Su banyosu çevrimli 42 ° C'ye kadar Karaciğer Perfüzyon Orta Sıcak 25 mi.
6. Polivinilpirolidon çözeltisi ile kaplanmış% 90 kolloidal silika hazırlayın: polivinilpirrolidon ile kaplanmış koloidal silika 9 ml 10x DPBS 1 ml ilave edilir. 0.1 N HCI kullanılarak pH 7.4'e ayarlayın. Steril 0.2 um şırınga filtresi ile filtre. Oda sıcaklığında saklayın.
7. 37 ° C sıcak bir orta kaplama.

İlköğretim Fare Hepatositlerin 2. izolasyonu

1. Peristaltik pompa, boru ve diseksiyon tablo ayarlama: steril su, 10 ml, ardından damıtılmış su içinde 5 mi,% 70 etanol ile yıkama ile boru sterilize edin. Doldurmak için Karaciğer Perfüzyon Ortamında boru ve koşmak pompayı yerleştirinborunun tüm uzunluğu.
2. Kurumsal onaylı yöntem ile fare Kurban.
3. Karın boşluğuna açık parçalara ayır:% 70 etanol ile liberal fare karın püskürtün. Künt uç makas kullanarak, dermis yoluyla karın uzunluğunu orta hat kesi yapmak ve yanal yansıtır. Iç organları maruz periton benzer bir kesi yapmak.
   1. Yavaşça bağırsak yerinden, künt aleti kullanarak karın damarlanma karın inferior vena kava (IVC) bulun ve renal ven distal damar altına bir dikiş, koyun ortaya çıkarmak için
4. Distal sütür için, dikiş düzeyde ötesine ilerleyen, IVC içine bir iğne ve kateter yerleştirin. Hala yerinde iğne ile yerde tutmak için kateter etrafında dikiş kravat. Dikkatlice iğneyi çıkartın. Eğer kateter yoluyla akışı ile, doğru bir şekilde kan yapılır.
5. Bir pipet kullanarak, sağlanması, perfüzyon ortamına kateter kalan alanı doldurmakBu hava mevcut. Büyük bir özenle, kateter tüp takmak.
6. Akciğer boşluğuna açık parçalara ayır: hafifçe diyaframa maruz üstün karaciğer lobları yansıtmaktadır. Dikkatle sonra keskin uçlu makas ile diyafram delinme safra kesesi ve plevra damarsal önlemek için özen, plevra boşluğu maruz yanal kesi yapmak. Hepatik ven sadece proksimal torasik inferior vena kava etrafında bir bulldog kelepçe yerleştirin.
7. Portal ven kesin ve 3 pompa açmak - / dk 4 ml. Perfüzyon ortamı, yaklaşık 20 ml ile 5 dakika boyunca karaciğer Perfüzyon Ortamı ile karaciğer serpmek.
   Not: Karaciğer hemen tan / gri kırmızı değişmelidir. Karaciğer bölümleri kırmızı kalırsa, bu büyük olasılıkla kötü perfüzyon gösterir ve başarılı izolasyon olasılığı büyük ölçüde azalır. Perfüzyon sırasında dışarı çalışmaz ortamı sağlamak için dikkatli olun ve hiçbir kabarcıklar tüp girmek söyledi.
8. 5 dakika inkübasyondan sonra, stopPompa ve Karaciğer Digest Orta boru aktarın. (Orta tükenene kadar) 15 dakika - pompayı yeniden başlatın ve başka bir 10 için karaciğer serpmek.
9. Perfüzyon sonunda pompayı durdurun. Karaciğer pembemsi renge sahip ve biraz genişlemiş görünmelidir. Dikkatli diseksiyon ile karaciğer tüketim. Safra kesesi çıkarın ve 10 cm doku kültürü çanak karaciğer aktarmak.
10. Bir biyogüvenlik kabini, karaciğere Kaplama Orta 10 ml (Tablo 1) ekleyin. Yavaşça hepatositler kaldırmak ya forseps veya neşter kullanılarak karaciğer kazıyın. 50 ml'lik konik tüp 100 mikron hücre süzgeç ve transfer kullanarak süspansiyon Filtre. 50 ml konik tüp ek bir 10 Kaplama Orta ml ve havuzlu plaka yıkayın.
11. 350 xg, 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri Pelet.
12. % 90 koloidal silika, 10 mi po ile kaplanmış Kültür ortamı basınçla Kaplama Orta 10 ml tekrar süspansiyon pelet ekleyinlyvinylpyrrolidone. Adım 2.11 gibi yavaşça ve santrifüj karıştırın. Canlı hücreler, alt pelet ise santrifüjlemeden sonra, ölü hücreleri bir tabakası, karışımın üzerinde yüzen olacaktır.
13. Aspire ölü hücreler ve orta. Kaplama Medium, 2.11 gibi santrifüj 20 ml 2 kez yıkayın.
14. Kaplama Orta 10 ml süspanse hücreleri. Bir hemasitometre ile hücre sayımı ve kollajen ile tedavi edilmiş 24 oyuklu kültür tabaklarında 9 x 10 ⁴ hücre / çukur yerleştirin. 2 saat boyunca 37 ° C'lik bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde inkübe edin. Her plaka, yağ asidi oksidasyon deneyi TD lipogenesis tahlilinde biri için kullanılabilir.
15. İsteğe bağlı olarak, 37 ° C 'de, muhafaza edici ortam (Tablo 1) ve kültür kuyularının değiştirin. Deney sonuçları etkilemeden 3 gün - Hücreler 2 kültürlenebilir.

3. Yağ Asidi Oksidasyonu Deneyi

Uyarı: radyoaktivite kullanılması tehlikeli olabilir. Tüm satın alma, depolama, elleçleme, ve diRadyoaktif maddenin sposal kurumsal, eyalet ve federal düzenlemeler ve kurallara uygun olarak yapılmalıdır.

1. 16 - 20 saat önce tahlil için, ılık PBS ile hücreler 2 kez yıkayın. 20 nM glukagon ile serumsuz serum açlık Ortamı (Tablo 1) hücreleri değiştirme ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   Not: fetal sığır serumu metabolik hormonların bilinmeyen bir konsantrasyon (örneğin insülin, glukagon) içerdiğinden, serum bu tahlilde üzerinde sahip olabileceği herhangi karıştırıcı etkileri ortadan kaldırmak için hücreleri açlıktan. Hücreler> 24 saat serum Açlık Ortamda yaşayabilir. Glukagon işleme hepatositlerde yağlı asit oksidasyonunu teşvik etmek için kullanılır.
2. Tahlilinde sabahı, ön inkübasyon ortamı, hazırlanması: 10 dakika boyunca 70 ° C'ye kadar, bir 100 mM çözelti ve ısı yapmak için, aşırı saf su içinde sodyum-palmitat, uygun bir miktarda yeniden süspanse edin. Bu arada, gerekli miktarda (24-iyi levha başına 0.5 mi) hazırlanması25 mM HEPES,% 1 BSA fraksiyonu V, ve 20 nM glukagon ile DMEM. 37 ° C'ye ısıtın.
   1. Çözündürülmüş sonra, ortama 250 uM nihai konsantrasyona kadar palmitat ekleyin. Orta-Kuluçka öncesi ve 2 saat 37 ° C'de inkübe hepatositlerin değiştirin. Daha sonra kullanılmak üzere 37 ° C 'de, bazı ön inkübasyon ortamı, ayırın.
3. İnkübasyon sırasında, nitrojen gazı altında buharlaştırma ile ¹⁴ C-palmitat, uygun bir miktarda (0,5 uCi / oyuk) kurutun.
   1. Örneğin, bir 24-çukurlu plaka içinde 24 örnekleri ölçmek için 1,5 ml'lik bir tüpe 0.1 uCi / ml ¹⁴ C-palmitat 120 ul transfer. Yavaş yavaş bir duman başlığı içinde 3-5 cm uzaklıktan çözelti üzerinden bir nitrojen gazı püskürtülerek solvent etanol buharlaştırılır. Tüpün alt kuru ^14C-Palmitat bırakarak, 40 dakika - çözücü içinde yaklaşık 30 buharlaşır gerekir.
4. Yaklaşık 15 dakika süreyle inkübe edildikten sona ermeden önce, ¹⁴ tekrar süspansiyon0,1 N NaOH içerisinde C = Palmitat (12.5 ul / uCi). 10 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe edin. Sıcak ön inkübasyon ortamı, üç hacim ekleyin ve aşağı yukarı pipetleme karıştırılır.
5. Seyreltilmiş ¹⁴ C-palmitat 25 ul her bir başak. Hafifçe plaka sallanmasıyla karıştırın ve 90 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bu deney, bir plakadır.
6. İnkübasyon sırasında, Filtre Kağıdı Plate (Şekil 1) hazırlar.
   1. Steril 24 plaka kapağı çıkarın. Kuyucuğun alt filtre kağıdı, bir 2 cm x 2 cm parçası yerleştirin. 4 "x 7" parafilm bir parça ile plaka Yerleşimi.
   2. Böyle bir mikropipet ucu kutusu gibi, büyük dikdörtgen bir nesne kullanarak, iyi açılışlarında parafilm perfore ve plaka geri kalanı üzerinde bir mühür oluşturmak için kuyular üzerinde parafilm ovalayın. Şimdi kuyuları kapsayan parafilm delikli çevreleri çıkarın. Plaka şimdi sıkı sıra o hariç tüm alanlarda parafilm ile kaplanmış olmalıdırpenings.
7. 10 dakika süreyle inkübe edildikten sona ermeden önce, bir filtre kağıdı tüm sıvı absorbe emin olarak, filtre kağıdı bir levhanın her çukuruna 3 N NaOH 200 ul ilave edin.
   1. Donmaya karşı isteğe bağlı olarak önceden bir taze 24-yuvalı plakaya orta aktarın. Bir kez PBS ile yıkandıktan sonra, 0.1 N HCI kalan hücreler lize edildi ve bir BCA aracıyla protein içeriğini hesaplar.
8. İnkübasyonun sonunda, sıvı nitrojen içinde Deney Plakası ek dondurularak. Tamamen geçmeden önce dondurulur her iyi sağlamak için dikkatli olun.
9. Deney plakası, her sıra için% 70 perklorik asit, 100 ul ekle. Hemen Filtre Kağıt Plate ile kaplayın. 2 st için oda sıcaklığında 80 rpm'de yörüngesel hızda bir orbital çalkalayıcı ve kaya plakaları yerleştirin.
10. İnkübasyondan sonra, örnekler işlem:
    1. Bir sintilasyon 4 ml sıvı sintilasyon sıvısına filtre kağıdı kareler transfer CO ₂ fraksiyonu ölçmek içinŞişe ve ölçü ¹⁴ C sinyali.
    2. Asit çözünebilir malzeme ölçen 1.5 ml mikrofüj tüpe orta 400 ul aktarma. 10 dakika süreyle maksimum hızda santrifüjleyin. Kısaca 1 kloroform-metanol (h / h) ve girdap: 2 500 ul Elde edilen üstte yüzere, 100 ul ekle.
       1. Yine karışımına su 250 ul ekleyin ve vorteks. 3,000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj örnekleri. Transfer sintilasyon şişesine 4 ml sıvı sintilasyon sıvısı üst fazın 200 ul ¹⁴ C sinyali ölçer.

4. lipogenez Deneyi

1. Akşam önce tahlil başlamadan, ılık PBS ile hücreler 2 kez yıkayın. 100 nM insülin Serum Açlık Orta hepatositler değiştirin. 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
   Not: fetal sığır serumu bir metabolik hormonların bilinmeyen konsantrasyonu (örneğin insülin içerdiğinden, glukagon), Serum Bu testte üzerinde sahip olabileceği herhangi karıştırıcı etkileri ortadan kaldırmak için hücreleri açlıktan. Hücreler> 24 saat serum Açlık Ortamda yaşayabilir. İnsülin lipogenez uyarmak için bu deneyde kullanılır.
2. 100 nM insülin, 10 uM soğuk asetat ve 0.5 uCi ^3H-asetat başına iyi Serum Açlık Orta: lipogenezi Orta olun. Lipogenez Ortama hücreleri değiştirmek ve 2 saat süre ile 37 ° C'de inkübe edin. Çıkar bileşiklerin, test edilecek içerir.
3. İnkübasyon süresinden sonra, hücreler PBS ile 2 kez yıkayın. 0.1 N HCI içinde 120 ul kazınarak Hücreleri,. Rezerv 10 protein tayini için ul (BCA tahlili ile değerlendirilmesi), ve transfer 1,5 ml mikrofüj tüpüne 100 ul.
4. 2 500 ul ilave edilerek özü lipidler: 1 kloroform-metanol (h / h). Vorteks kısa ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Su, girdap 250 ul ekleyin ve ek 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Santrifüj örnekleri 3000 x g'de oda sıcaklığında 10 dakika. ÖzenleBir sintilasyon şişesine 4 ml sıvı sintilasyon sıvısına alt faz transferi ve ³ H aktivitesini ölçmek.

3 x 10 ⁷ toplam hücre - hepatosıt izolasyonlar genellikle 1 ile sonuçlanır. Gece boyunca inkübasyondan sonra, hücreler (Şekil 2), binükleer olacak birçoğu altıgen görünür. Sağlıklı hücreler, hücre ölümü göstergesidir granülasyon veya kabarcıkların, yoksun olmalıdır.

Genel olarak, yağ asidi oksidasyon deneyi, test bileşiği başına üç ila dört kez tekrarlanmış çalıştırılır. _CO2 numune için sayımlar asit çözünür malzeme elde edilenler yaklaşık beşte biri olan. Genellikle (diğer bir deyişle, sitrik asit döngüsü yoluyla okside miktardır) tam oksidasyon ölçüsü olarak asitte çözünür malzemeye _CO2 oranı hesaplanır. Böyle Karbonil siyanür-4- (triflorometoksi) fenilhidrazonun (FCCP) olarak hücresel solunum teşvik maddeler, TCA döngüsü üzerinden daha fazla oksidasyon belirten _CO 2 doğru bu oranı kayacak. Solunum zinciri inhibitörleri bütün oksidasyonu azalacak(Şekil 3). Bu tahlil pilot, bu prosedür, hücre spesifik aktivitesinin üretilmesi olduğunu doğrulamak için bir no-hücresi kontrolü de en iyi yoldur.

Lipogenez Deneyi en çok sıfır zaman noktası kontrol (hemen önce, alt-tabaka hasat ile tedavi edilen hücreler) ile karşılaştırılır. Deney kuluçkalama en az dört saat boyunca zamana karşı doğrusal olmalıdır. Örneğin oligomycin gibi FCCP gibi yağlı asit oksidasyonunun geliştirilmesi, ATP sentezi azaltan bileşikler, lipojenik aktivitesi (Şekil 4) azaltacaktır.

Şekil 1: Adım 3.6 açıklandığı gibi filtre plakasını hazırlamak için Filtre Plate hazırlanması, steril bir 24 plaka kapağı çıkarın. Her bir gözün tabanında bir filtre kağıdı 2 cm x 2 cm parçası yerleştirin. Para bir 7 "x 4" parçası ile tüm plaka YerleşimiFilm ve sıkıca kuyu üst mühür plaka ovalayın. Bu kaldırılması gerektiğini de açıklıklar, üzerinde parafilm perfore çevreler üretecektir. Aşama 3.9 perklorik asit ilave edildikten sonra, bir yalıtım elde etmek için deney plakası üzerinde sıkı bir biçimde Filtre Kağıdı plaka yerleştirin.

Şekil 2: Kültür fazında birincil hepatositler 16 saat kollajen kaplı 24 oyuklu plakalar içerisinde kaplama sonrası, sağlıklı ve sağlıksız primer fare hepatositlerinin görüntü kontrast. Ölçek çubuğu, 200 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: Primer tarafından Yağ Asidi Oksidasyonu Kültür ¹⁴ (A), CO _2, (B) asit-aktif çözünür malzeme ve (C) bir araç, FCCP veya oligomycin kullanılarak inkübe edilmiş primer hepatosit asitte çözünür malzeme _CO2 oranı C-Palmitat oksidasyonu Fare Hepatositler. Veriler ortalama ± SEM. * p <0.05, tek kuyruklu Student t-testi ile aracın vs ** p <0.01. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: lipogenez kültürlenmiş birincil fare Hepatositler (A) ³ 'H-asetat ve araç, oligomycin veya FCCP mevcudiyetinde (B) lipojenik aktivitesi ile tedavi edilen primer hepatositlerinde zamana karşı lipojenik aktivitesi. Veriler ortalama ± SEM. *** p İçerik "> Tablo 1: primer hepatositlerinde izolasyonu için kültür ortamı Kültür Ortamı Bileşimi.

Perfüzyon kurban gelen zaman ideal bir perfüzyon ve karaciğer kollajenaz sindirimi için en az 3 dakika olmalıdır. Perfüzyon Orta ile perfüzyon başlatılır sonra, karaciğer hemen kırmızı soluk ila görünümünü değiştirmek gerekir. LDM inkübasyonu yaklaşık 10 dakika sonra, karaciğer, şişmiş ve pembe görünür. Perfüzyon yetersiz olması halinde, karaciğer, bu değişiklikler göstermezler olabilir ve bu, tipik olarak daha düşük bir hepatosit verimle sonuçlanır.

Yıkama adımlarının ardından, izole edilmiş hepatositler önce kaplama buz üzerinde süspansiyon birkaç saat saklanabilir. Kaplama sonra, kültürlü hepatositler yapışır ve yaymak için birkaç saat gerektirir. Kaplama Orta inkübasyon 2 saat sonra, hepatositler, küçük ve yuvarlak kalacaktır. Bir gecelik inkübasyondan sonra, hepatositler, binükleer olacak çoğu bir daha karakteristik altıgen görünüm alacak. Hazırlık sağlıksız ise, carşın hücre ölümünün bir göstergesi sayıda granülasyonların ve zaman zaman kabarmasıyla, arzedecektir. En iyi kültür canlılığını korumak için, medya her 24 saat değiştirilmesi gerekir ve açık havaya maruziyeti en aza indirmek için alınan bakım.

Sodyum palmitat tamamen erimesi gerekir 70 ° C'de inkübasyondan sonra, ancak oda sıcaklığında su içinde çözünmez. Oda sıcaklığına maruz kalma bu nedenle hızlı bir şekilde çalışması için şart, lipid hızla katılaşmasına sebep olur. Palmitat ön inkübasyon ortamı içinde çözüldü sonra, bu lipidlerin çözünürlüğünün muhafaza edilmesi amacıyla, 37 ° C'de orta korumak için önemlidir.

Yukarıda belirtildiği gibi, yağ asit oksidasyonu tahlilinden doğru sonuçlar sağlamak için orta sıvı nitrojen içinde tamamen donmuş olmalıdır. Bu çukurlara perklorik asit ilavesi sırasında _CO2 herhangi kaçmasını önler. Hemen Dondurulmuş örnekler perklorik asit ilave edildikten sonra, bir deney plakası sıkı c olmalıdırFiltre Kağıt Tabak tarafından overed, kuyular arasındaki gaz transferi için plakaları hizalamak için emin olun. Filtre kağıdı NaOH fazlası ile ıslatılır için, reaksiyonun orantılar hesabına göre NaHCO ₃ olarak piyasaya CO ₂ yakalama yeteneğine sahiptir. Bu protokol deneyler, tipik çoğaltır olan% CV, yeniden üretilebilir sonuçlar elde var ≤ Gerekirse 10., yağ asit oksidasyonu deneyi ya da lipogenesis tahlilinden hücre lizatından asit-aktif çözünür malzeme -80 ° C'de saklanan ve işlenmiş olma yeteneğine sahip Daha sonra sonuçlar üzerinde kayda değer herhangi bir etkisi yoktur. Yukarıda tarif edilen deneyler, fare karaciğerinden izole edilen primer hepatositlerinde lipid metabolizmasını değerlendirmek için nispeten basit ve etkili bir mekanizma süresi sağlar. Ex vivo kültür kullanımı sayesinde, bu yöntemler, yağ asidi oksidasyon ve lipogenez çeşitli koşulların etkilerini test izin verir. Bu protokol, bu prosedürü ile ilgili genetik değişiklikler rolünü değerlendirmek için adapte edilebilirD eğ Bununla birlikte, hepatositlerin yalıtım zamanı sınırlayıcı değildir ve bu nedenle, in vivo olarak belirli bir transgenik hayvan modelleri araştırmak için daha uygun olabilir analiz eder. Birden çok hepatosit preparatların analizi gerekli ise isteğe bağlı aşama 3.7.1 açıklanmıştır ve normalleştirilmesi için kullanıldığı haliyle protein seviyeleri test değerleri normale gerçekleştirilebilir. Biz birden hazırlıkları yapılan deneyler, uygun bir kontrole karşı göreceli değişiklikler olarak karşılaştırılabilir öneririz.

Son olarak, daha uzun kültür dönemleri seçeneği araştırılmalıdır değil, ancak, hepatositlerin kültür içinde birkaç gün sonra eş metabolik özellikleri sergileyebilir. Küçük bir değişiklik, bu protokol lipid metabolizması üzerinde bileşiklerin etkisini değerlendirmek önce birkaç günlük tedaviler için izin vermek için adapte edilmiş olabilir.

The authors indicate they have no conflicts of interest.

We would like to acknowledge Susan Gray and Umadevi Chalasani for their help with technical aspects of the hepatocyte isolation protocol. This work was supported by NIDDK grant 5R01DK089185 (to M.P. Cooper) and the DERC Pilot and Feasibility Program at UMMS (to M.P. Cooper).