Цель нашего исследования — понять взаимосвязь между распространяющейся деполяризацией и легкими черепно-мозговыми травмами с использованием моделей мозга. Наша группа и другие недавно показали, что распространяющаяся деполяризация происходит при легких травмах закрытого черепа у мышей. Обычно используемые усилители электрофизиологии in vivo отфильтровывают медленные внеклеточные сдвиги, связанные с распространяющейся деполяризацией, что делает практически невозможным обнаружение распространяющейся деполяризации.
Преимущество этого протокола заключается в использовании как визуализации, так и электрофизиологии in vivo для подтверждения отсутствия или присутствия распространяющейся деполяризации после легкой черепно-мозговой травмы. Мы начали понимать роль распространения деполяризаций в остром поведении, патологии и долгосрочном когнитивном дефиците, связанных с ЧМТ. Для начала поместите животное под наркозом в стереотаксическую рамку и поддерживайте температуру тела животного с помощью грелки.
С помощью лезвия скальпеля под номером 10 сделайте надрез по средней линии от рострального к каудальному. И сразу же нанести на разрез цианоакрилатный клей. Затем раздвиньте кожу в сторону, чтобы обнажить череп.
Добавьте еще одну-две капли цианоакрилатного клея на череп, чтобы обеспечить дополнительную защиту. Пока клей высыхает, используйте стерильные хирургические ножницы, чтобы увеличить размер разреза над мозжечком. Далее с помощью сверла диаметром 0,8 мм просверлите направляющие отверстия в черепе и вкрутите винты в череп.
Намотайте лишнюю проволоку на винт, чтобы в дальнейшем можно было немного ослабить обстановку для размещения головной сцены. Как только все винты с головкой будут на месте, вставьте все золотые контакты в нужный разъем ступицы головки. Удерживая разъем на месте с помощью стереотаксического рычага, расположите контакты разъема близко над головками винтов без контакта с проводом.
Запечатайте всю область цианоакрилатным клеем, убедившись, что область визуализации перед винтами черепа не нарушена. Нанесите стоматологический цемент вокруг основания золотых штифтов, следя за тем, чтобы золотые штифты от винтов черепа не были соединены с штифтами в головной сцене. Дайте стоматологическому цементу застыть, прежде чем снимать соединитель головного столика.
Для начала включите компьютер IOS и плату светодиодной панели. Установите животное, которому имплантировали электроды под наркозом, в противоударную кровать под камерой. И отрегулируйте кольцо фокусировки так, чтобы оно охватывало кортикальную поверхность.
После загрузки встроенного оптического сигнала или настроек IOS нажмите кнопку Live для просмотра мыши и центрирования черепа животного под камерой. Затем нажмите Multi-D Acquisition, чтобы получить доступ к настройкам съемки и выбрать нужные временные точки. Сохраняйте изображения по указанному пути к файлу с соответствующим префиксом имени.
Подсоедините золотые контакты от животного к разъему головной ступени, а затем к головной сцене. Включите электрофизиологический компьютер и подключите компьютер к электрофизиологическому оборудованию. После загрузки настроек программного обеспечения Intan нажмите на значок «Выбрать формат файла» и во всплывающем окне выберите «Формат типа одного файла на сигнал».
Затем на вкладке BW в разделе Hardware Bandwidth (Аппаратная пропускная способность) выберите полосу пропускания усилителя от 0,13 до 500 герц. Выберите «Широкий» в разделе «Фильтр отображения Селектор». После установки фильтров нижних и высоких частот нажмите на значок «Выбрать имя файла», чтобы выбрать желаемый путь к файлу для сохранения.
Для удара включите электромагнитный импактор и щелкните рычагом, чтобы проверить, правильно ли втягивается и выдвигается наконечник. Быстро поместите животное на поролоновую подстилку и сдвиньте подстилку под кончик ударного элемента. Совместите кончик ударного элемента со средней линией и расположите его на расстоянии одного миллиметра от брегмы.
Затем опустите кончик ударного элемента до тех пор, пока он плотно не коснется макушки головы животного. Нажмите на рычаг, чтобы втянуть наконечник ударного элемента, затем вручную опустите его на пять миллиметров, прежде чем активировать ударный рычаг. Немедленно снимите животное с поролонового слоя и поместите его под камеру для съемки в течение пяти секунд.
Нажмите кнопку «Захватить», чтобы запустить визуализацию IOS в окне «Многомерное сканирование». Делайте снимки в течение четырех минут, чтобы записать все событие деполяризации. Чтобы начать запись электрофизиологии, нажмите на иконку «Запись» в программе Интан.
По завершении записи отключите животное от головного столика и разъема и поместите его обратно в клетку. Чтобы открыть стек изображений, нажмите «Файл», а затем «Импорт и последовательность изображений». Нарисуйте квадрат с помощью курсора, определяющего интересующую область, чтобы построить график распространяющейся деполяризации.
Перейдите в раздел «Изображение», затем «Стопки» и «Построить профиль по оси Z», чтобы построить график, и нажмите кнопку «Онлайн». На сгенерированном графике нажмите «Список», чтобы создать список значений. Для визуализации преобразуйте изображение в оттенках серого с помощью таблицы поиска огня.
Наблюдалось распространение деполяризаций, распространяющихся по коре головного мозга и крупным кровеносным сосудам через окно. Высокочастотная активность в электрофизиологических записях показала быстрое возвращение у фиктивных животных после удаления изофлурана. Но у деполяризованных животных высокочастотная активность оставалась подавленной в течение нескольких минут до выздоровления.
Силовые графики продемонстрировали явный рост мощности после восстановления после подавления в обоих условиях.
