Этот протокол позволяет идентифицировать партнеров по связыванию белков известной последовательности РНК путем их извлечения из клеточного экстракта с использованием биотинилированных олигонуклеотидов РНК. По сравнению с методами, требующими детергентов или высоких температур для отделения белков от РНК, эти протоколы вместо этого используют очень мягкие условия, что позволяет также сохранять потенциальные белковые комплексы. Продемонстрацией процедуры будет Якоб Руперт, аспирант по моему обеспечению.
Начните общий сбор белка с удаления среды из лунок клеточной пластины HEK 293T и промойте лунки шести лунок одним миллилитром PBS. Откажитесь от PBS и перенесите пластины на лед, прежде чем добавлять 200 микролитров лизисного буфера в каждую лунку. Отсоедините и разбейте клетки с помощью клеточного скребка, прежде чем переносить экстракт клеток, полученный из двух лунок, в одну и ту же пробирку объемом 1,5 миллилитра.
После 30 минут инкубации на льду и центрифугирования переложите надосадочную жидкость в предварительно охлажденную пробирку. Далее рассчитайте объем белкового экстракта, соответствующий 1,5 миллиграммам белков. Затем доведите все образцы до конечного объема 600 микролитров с помощью буфера для лизиса.
Держите образцы на льду до использования. Чтобы приготовить бусины, смешайте их в буфере для хранения, щелкнув тюбиком. После расчета 100 микролитров суспензионной среды на образец поместите рассчитанный объем суспензии в магнитную стойку.
Чтобы промыть бусины, удалите раствор для хранения и вымойте бусины, добавив один миллилитр буфера для лизиса и перевернув его вручную. Затем снимите буфер с помощью магнитной стойки и повторите этап стирки. К шарикам добавьте объем буфера для лизиса, равный начальному объему суспензионной среды, и перемешайте его, щелкнув пробиркой, прежде чем равномерно распределить среду по 1,5 миллилитровым пробиркам в качестве образцов.
Для блокировки шариков удалите буфер с помощью магнитной стойки и добавьте 600 микролитров 0,25 миллиграмма на миллилитр дрожжевого раствора TRNA, приготовленного в лизисном буфере. Инкубируют его в течение одного часа при комнатной температуре на вращающемся колесе. Удалите раствор TRNA с помощью магнитной стойки перед добавлением 600 микролитров лизисного буфера и промойте его, смешав вручную.
Повторите этап стирки и выбросьте буфер. Для каждой пробирки, содержащей исходные 100 микролитров суспензионной среды, готовят 200 мкг олигонуклеотида РНК в 600 микролитрах лизирующего буфера. Добавьте олиго в шарики и выдерживайте в течение одного часа при комнатной температуре при вращении.
Удалите раствор из шариков и дважды промойте 600 микролитрами лизисного буфера, вращая пробирки в течение пяти минут каждая при комнатной температуре. Откажитесь от буфера. Для связывания белка на шариках отделите 5% или 30 микролитров объема от 600 микролитров белкового раствора и сохраните его в качестве входного или внутримышечного раствора для дальнейшего анализа.
Добавьте оставшуюся белковую смесь в каждую пробирку загруженных шариков и инкубируйте с медленными вращениями в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Удалите несвязанную белковую фракцию из шариков с помощью магнитной стойки. Сэкономьте 5% или 30 микролитров его объема и пометьте его проточным или FT. Добавьте один миллилитр буфера для стирки 1 к шарикам и вращайте его в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Выбросьте буфер и повторите эту стирку один раз. Добавьте один миллилитр буфера для стирки 2 к шарикам. А после инкубации при четырех градусах Цельсия на ротаторе в течение пяти минут выбросьте надосадочную жидкость.
Для элюирования конкретных связующих добавьте к шарикам 100 микролитров буфера для элюирования 1. После смешивания вручную взбивайте его в течение пяти минут при комнатной температуре. Поместите трубки в термомиксер и энергично встряхивайте в течение пяти минут при температуре 95 градусов по Цельсию.
Затем поместите трубку в магнитную стойку и соберите элюированную фракцию в чистую пробирку. После этого быстро скрутите шарики с помощью настольной центрифуги, чтобы максимизировать извлечение элюата. И сэкономьте 5% или пять микролитров от общего объема элюата или EL для дальнейших анализов.
Элюированные белки были идентифицированы с помощью масс-спектрометрии. Построение графика значительно обогащенных белков на графике вулкана показало, что общее содержание белка и обогащенные белки, элюированные из РНК, были значительно выше, чем РНК, что позволяет предположить, что РНК может устанавливать большее количество специфических взаимодействий. В качестве примеров согласования между предсказанными и полученными результатами оценки взаимодействия для плюсовой РНК и минусовой РНК с белками из протеома человека показали, что HNRNPH3 предсказывает селективное связывание плюс РНК, а PCBP2 специфически взаимодействует с РНК.
Кроме того, было предсказано, что белок RBM41 будет беспорядочным для обоих олигонуклеотидов РНК. Масс-спектроскопический анализ образцов анализа белка подтвердил наличие HNRNPH3 в РНК и PCBP2 в минусовой РНК. В то время как было обнаружено, что RBM41 взаимодействует с обоими.
Вестерн-блоттинг был использован для обнаружения присутствия TDP-43 в результатах и шагах оптимизации протокола. В РНК TDP-43 наблюдался во входном образце и элюате, что указывает на его присутствие с самого начала. TDP-43 удерживался РНК во время этапов промывки и элюировался в конце буфером с высоким содержанием соли.
Картируя взаимодействия белковой РНК, этот метод может выявить макромолекулярные сети, стоящие за многими физиологическими путями. Например, транскрипционная регуляция или патологические механизмы, включая рак и нейродегенерацию.
