Таким образом, клетки-предшественники взаимодействуют с окружающей средой для поддержания гомеостаза тканей. И с помощью этого протокола мы можем начать понимать, как фибробласты влияют на поведение клеток-предшественников пищевода. Система совместного культивирования использует сначала изолированные клетки, которые имитируют нормальную нишу-предшественника пищевода.
Очистка органоидов перед визуализацией позволяет анализировать как клеточные взаимодействия, так и морфологию органоидов. Этот метод может быть применен к органоидам пищевода человека. Например, с использованием материалов здоровых или онкологических больных.
При этом мы можем получить представление о специфической функции фибробластов, связанных с раком. Диссоциация эпителиальных и стромальных клеток имеет решающее значение для получения жизнеспособных органоидов. Недостаточное переваривание приведет к низкому выходу клеток, где чрезмерное переваривание снизит жизнеспособность клеток и способность к образованию органоидов.
Для начала механически удаляют наружную мышечную мышцу пищевода с помощью диссекционного микроскопа и щипцов. Удерживайте дистальный конец рассеченного пищевода с помощью одной пары щипцов и используйте другие щипцы, чтобы захватить и вытянуть мышцу от дистального к проксимальному концу пищевода. Удалите и выбросьте мышечный слой.
Чтобы открыть пищевод в продольном направлении, возьмитесь за один конец пищевода и вставьте шарик пружинных ножниц для микрорассечения в просвет, чтобы предотвратить повреждение тканей. Разрежьте пищевод, держась за конец, и поместите его в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра или пластину с 24 лунками. Погрузите открытый пищевод в 0,5 миллиграмма на миллилитр термолизина в HBSS и инкубируйте при 37 градусах Цельсия на шейкере в течение 15 минут.
После удаления пищевода из раствора термолизина осторожно отделяют эпителий пищевода от стромы. Перенесите эпителиальный и стромальный слой в две отдельные 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки с 200 микролитрами диссоциативного раствора в HBSS и поместите их на лед. Измельчите эпителий пищевода с помощью острого скальпеля и соберите измельченную ткань из чашки Петри с 200 микролитрами диссоциативного раствора.
Переложите его в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Добавьте 800 микролитров свежего диссоциирующего раствора и поместите пробирку с измельченным эпителиальным слоем на шейкер при температуре 37 градусов Цельсия на 60 минут. Пипеткой вводите раствор вверх и вниз примерно 20 раз, используя наконечник пипетки объемом 200 микролитров каждые 15 минут.
Разрежьте стромальный слой на мелкие кусочки в 1,5-миллилитровой пробирке, содержащей 200 микролитров диссоциационного раствора, с помощью диссекционных ножниц и добавьте 800 микролитров свежего диссоциационного раствора. Поместите трубку на шейкер при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут. После 30 минут инкубации стромального раствора и 60 минут инкубации эпителиального раствора пипеткой вводите раствор вверх и вниз еще 20 раз.
Пропустите стромальный раствор через 70-микрометровый клеточный фильтр, а эпителиальный раствор через 40-микрометровый клеточный фильтр в новые 1,5-миллиметровые микроцентрифужные пробирки. Центрифуга при 300 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость, удалив лишнюю жидкость пипеткой объемом в один миллилитр. Ресуспендировать гранулу в 200 микролитрах смеси антител.
После переноса смеси в проточную цитометрическую пробирку инкубируйте клетки в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Добавьте три миллилитра 1% FBS и снова центрифугу в течение пяти минут. Затем ресуспендируют клетки минимум в 200 микролитрах 1% FBS.
Добавьте один к 10 000 разбавленных маркеров окрашивания мертвых клеток за пять минут до сортировки по факсу, чтобы изолировать живые клетки. Смешайте отсортированные эпителиальные клетки и фибробласты в пробирке в соотношении один к двум. После центрифугирования при 300 г в течение пяти минут выбросьте надосадочную жидкость, осторожно удалив ее пипеткой объемом 200 микролитров.
Промойте клетки один раз, ресуспендировав гранулы в холодной основной органоидной среде, и снова центрифугируйте в течение пяти минут. Поместите клетки на лед и выбросьте надосадочную жидкость, осторожно удалив ее пипеткой объемом 200 микролитров. Ресуспендируйте клетки в 10 микролитрах матричной смеси на купол и поместите трубку обратно на лед.
Возьмите предварительно разогретую 48-луночную тарелку из инкубатора с температурой 37 градусов по Цельсию и сделайте по одному матричному куполу на лунку. С помощью пипетки объемом 20 микролитров добавляют 200 микролитров предварительно подогретой среды с низким содержанием ER к матричным куполам, содержащим органоидные кокультуры, и среду ENR к соответствующим матричным куполам, содержащим только эпителиальные органоиды. Поместите тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.
И в течение первых двух дней дополняйте среду 10-микромолярным ингибитором породы. Удалите органоидную среду и добавьте в матричные купола 200 микролитров ледяного PBS. Поместив пластину на лед на пять-10 минут, пипеткой вверх и вниз и переведите раствор в неприлипшую пробирку объемом 0,6 миллилитра.
Центрифугу в течение 30-60 секунд при 100G, чтобы органоиды осели на дне. После удаления лишней жидкости добавьте ледяной PBS в пробирку и снова центрифугу в течение 30-60 секунд. Удалите лишнюю жидкость, как показано ранее, и зафиксируйте органоид 200 микролитрами холодного, 4%-ного формальдегида в растворе PBS на 30 минут на льду.
Поместите трубку вертикально, чтобы органоид утонул и удалил формальдегид. Добавьте 500 микролитров холодного PBS, чтобы смыть остатки формальдегида. Удалив излишки PBS, добавьте 500 микролитров блокирующего буфера.
Поместите трубку на шейкер на 60 минут при комнатной температуре. Удалите блокирующий буфер и ресуспендируйте органоиды в 200 микролитрах блокирующего буфера с первичными антителами. Снова поместите органоиды на шейкер на ночь при температуре четыре градуса Цельсия.
Удалите смесь первичных антител и промойте органоиды, используя 500 микролитров 0,02% Triton X 100 в PBS в течение 60 минут при комнатной температуре. Повторите это три раза. Точно так же удалите промывочный буфер и добавьте 200 микролитров флуоресцентного конъюгированного вторичного антитела в блокирующий буфер на ночь при четырех градусах Цельсия.
Повторно промывайте органоиды, используя 0,02% Triton X 100 в PBS, а затем 500 микролитров PBS. Удалив всю лишнюю жидкость, добавьте к органоидам 10 микролитров очищающего раствора и выдержите 15 минут при комнатной температуре. Поместите 0,05-миллиметровую двустороннюю липкую четырехлуночную спейсер на предметное стекло микроскопа.
Добавьте 10 микролитров очищающего раствора с органоидами в одну лунку и поместите защитное стекло поверх прокладки. Получение изображений с помощью системы конфокальной микроскопии. Клетки-предшественники пищевода сортируются на основе их высокой интегрированной экспрессии бета-четырех и e-кадгерина.
Репрезентативный график проточной цитометрии выделения эпителиальных клеток показывает процент живых клеток из всех отдельных клеток. Здесь показан процент изолированных клеток-предшественников интегрина бета четыре и e-кадгерина из всех живых клеток. Графики проточной цитометрии, показанные здесь, представляют процент изолированных альфа-положительных фибробластов рецепторов DPP4+ и Pdgf.
Изображения светлого поля с органоидами, культивируемыми совместно с рецептором Pdgf альфа H2 BEGFP-положительными фибробластами, показывают ядерный сигнал EGFP. Здесь показаны изображения яркого поля всего купола матрицы на шестой день. Эффективность формирования органоидов представлена этим графическим изображением.
Каждая точка представляет собой матричный купол, а столбец представляет среднее значение всех точек на условие. Здесь показаны яркое поле и флуоресцентные изображения органоидов шестого дня, совместно культивируемых с альфа-положительными фибробластами рецептора Pdgf. На всех изображениях совместно культивируемых органоидов показаны 3D-поверхности органоидов с виментин-положительными фибробластами, обернутыми вокруг органоида и находящимися в тесном контакте с ним.
Полное окрашивание моно- и кокультивируемых органоидов альфа-положительными фибробластами рецептора Pdgf выявляет различные базальные и супрабазальные клеточные популяции. На эффективность формирования органоидов, а также на размер органоидов влияет фибробласт, входящий в кокультуру. Вариации и результаты следует ожидать при использовании различных субпопуляций фибробластов.
Та же стратегия может быть использована для характеристики связанных с опухолью фибробластов как у мышей, так и у людей.
