Виды подорожника могут быть использованы в качестве модельных растений для сосудистой биологии растений и физиологии стресса. Создание протокола трансформации позволяет проводить углубленные исследования этих растений для изучения взаимосвязи между генами и связанным с ними фенотипом. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он использует продукты в качестве эксплантов для преобразования узколистного подорожника с высокой эффективностью.
Для начала поместите имеющиеся в продаже семена подорожника ланцетного дикого типа в центрифугу объемом 50 миллилитров до отметки 5 миллилитров, в зависимости от желаемого количества растений. Погрузите семена в 75% этанол на 60 секунд. После выброса этанола погрузите семена в свежеприготовленный 20% гипохлорит натрия на 40 минут, осторожно перевернув трубку.
Под проточным колпаком ламината выбросьте раствор гипохлорита натрия, затем промойте семена пять раз дистиллированной водой. Добавьте небольшое количество воды к семенам после окончательного ополаскивания, так как это может помочь перемещению растений на тарелки. Используя стерильные щипцы, перенесите семена на заранее подготовленную чашку Петри с твердой средой MS, равномерно распределив семена по поверхности пластины, примерно на 1 сантиметр между каждым семенем, чтобы предотвратить переполнение прорастающих сеянцев.
Запечатайте пластину двумя слоями парафиновой пленки, чтобы предотвратить загрязнение, и инкубируйте под холодным белым светом для выращивания при комнатной температуре. Как только саженцы прорастут и станут достаточно большими для переноса, обычно после двух или трех дней прорастания, используйте стерильные щипцы и перенесите саженцы в стерильные коробки, содержащие от 50 до 100 миллилитров MS Medium. Заклейте коробки хирургической лентой и дайте растениям расти под прохладным белым светом в течение трех-четырех недель.
Нанесите полосы Agrobacterium tumefaciens, содержащие желаемую плазмиду, на подготовленную твердую пластину LB с соответствующим селекционным агентом. Инкубируйте запечатанную парафином пластину при температуре 28 градусов Цельсия до 48 часов или до тех пор, пока бактерии не станут достаточно большими, чтобы их можно было собирать. После инкубации соберите колонию бактерий с помощью наконечника пипетки за два дня до трансформации и инокулируйте ее в 15-миллилитровую пробирку с круглым дном, содержащую шесть миллилитров жидкого LB, с соответствующим селекционным агентом.
Встряхивайте при 200 об/мин в настольном шейкере с температурой 28 градусов Цельсия в течение ночи, пока OD 600 не достигнет 0.6–0.7. Как только бактерии достигнут требуемого OD, перенесите 200 микролитров бактериальной культуры в стерильную колбу, содержащую 100 миллилитров LB с селекционным агентом. Встряхните со скоростью 200 об/мин при 28 градусах Цельсия на ночь.
Затем переложите бактериальную культуру в стерильные центрифужные пробирки объемом 50 миллилитров и центрифугу при 2 200 г в течение 10 минут при комнатной температуре для сбора бактерий. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте бактериальную гранулу в пяти миллилитрах свежеприготовленного раствора суспензии или SS при комнатной температуре путем пипетки. Затем добавьте еще SS до отметки 50 миллилитров и переверните несколько раз, чтобы перемешать.
Как только растения достигнут идеальной стадии трансформации, примерно через три недели, используйте стерильные щипцы и ножницы, чтобы отделить корни от растения и выбросить листовой и стеблевой материал. Сразу после срезания асептически перенесите кусочки корня в ящики со стерильной водой с помощью щипцов, чтобы они не обезвоживались. Затем перелейте суспендированную бактериальную культуру SS Agrobacterium tumefaciens в стерильные одноразовые чашки Петри размером 150 на 15 миллиметров.
Перенесите срезанные корни в бактериальную культуру и выдерживайте не менее 20 минут. Во время инкубации стерильным скальпелем с острым лезвием разрежьте корни на односантиметровые фрагменты, отделяющие первичные корни от боковых. Затем сделайте тонкие неглубокие надрезы на поверхности корней, чтобы позволить бактериям заразить растение.
После инкубации переложите кусочки корня на стерильные бумажные полотенца, чтобы удалить лишние бактерии. Затем перенесите высушенные корни в подготовленные чашки Петри, содержащие твердые среды для совместной культуры, от 10 до 20 корней на тарелку, в зависимости от размера корней. Запечатайте пластины двумя слоями прозрачной пластиковой пленки, а затем алюминиевой фольгой для инкубации при комнатной температуре в течение трех дней.
После трех дней инкубации. В средах для совместной культуры перенесите кусочки корня в подготовленные чашки Петри с твердой индукционной средой или SIM с 500 миллиграммами на литр теметина и соответствующим подбором антибиотиков. Инкубируйте прозрачные пластиковые пластины, закрытые пленкой, под растущим светом в течение одного месяца или до тех пор, пока не начнут появляться всходы.
После того, как ростки вырастут от 1,5 до 2,0 сантиметров в длину. Переложите их в подготовленные стерильные коробки. С твердыми корневыми индукционными средами.
Выращивайте растения под растущим светом в течение нескольких недель, пока не образуются корни. Как правило, через неделю, когда корневые системы становятся достаточно большими, чтобы их можно было переносить, как правило, через месяц роста, возьмите растение и осторожно промойте корни водой, чтобы удалить любую среду, которая прилипает к корням. Затем переложите растения в квадратные горшки диаметром 3,5 дюйма, содержащие предварительно увлажненную универсальную почву, накройте растения пластиковой крышкой, а затем прозрачным пластиковым пакетом, чтобы растения оставались во влажной среде.
Этот метод был опробован на корневом листе и мелких старых тканях. В предварительном эксперименте, хотя мозоль могла быть индуцирована во всех типах тканей, только корневая ткань произвела инициалы побегов через один месяц в SIM, лист и педаль стали коричневыми и умерли. Прогрессирование инициалов побегов, выходящих из трансформированной ткани, наблюдалось с первых суток.
Корни помещали на SIM-карту до тех пор, пока побеги не были готовы к укоренению. Через неделю в корневой ткани образовалась мозолистая в начале побега инициалы. Всходы продолжали появляться в течение второй и третьей недель, а через четыре недели побеги были готовы к переносу в среду для индукции корней.
Идентификация карательных трансгенных растений проводилась с использованием гистохимического анализа бета-глюкуронидазы GUS с использованием сегментов листьев, взятых после того, как побеги достигли длины около 0,5 сантиметра. Дикий тип в преобразовании с пустыми векторами не показывает узор окрашивания. Из-за отсутствия гена GUS трансформация с геном GUS бета-глюкуронидазы показала четкий синий окрас в венах, подтверждающий, что растения являются трансгенными. Корни всегда следует держать гидратированными, чтобы предотвратить высыхание во время процедуры. Переносите корни примерно по 10 за раз, чтобы предотвратить это.
