В этом протоколе описан метод подсчета эритроцитарных опухолевых клеток и клинического выделения ЦОК. Для начала культивируют опухолевые клетки MCF-7, MDA-MB-231 и HeLa в колбе для клеточных культур в количестве от 10 до пятой в одном миллиметре DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллин-стрептомицина. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа.
Когда клеточные линии вырастут в виде адгезивных монослоев до 95%-ного слияния, отделите их от чашки для культивирования 0,25%-ным раствором трипсина на две минуты. Окрасьте опухолевые клетки, добавив три микролитра Calcein AM, и поместите чашку в инкубатор на 30 минут. В конце инкубации переварите все клетки трипсином.
Подсчитывают культивируемые опухолевые клетки в PBS с помощью клеточной счетной камеры и разводят до получения 100 опухолевых клеток на один миллилитр PBS. Далее разбавленную клеточную суспензию вводят в микрофлюидный чип с помощью шприца со шприцевым насосом с переменной скоростью потока. Получите эффективность улавливания для различных скоростей потока и определите оптимальный расход.
Подсчитайте количество опухолевых клеток, захваченных на чипе и вытекающих из выходного отверстия. Рассчитайте эффективность захвата по приведенной формуле. Повторите процедуру, чтобы получить эффективность захвата для разного количества опухолевых клеток, от 10 до 100.
Протестируйте и подтвердите микрофлюидный чип на наличие редкого количества опухолевых клеток. Введите эти 10 образцов суспензии в микрофлюидные чипы с помощью полой иглы, изготовленной из микропипетки, для аспирации разбавленных опухолевых клеток. Обнаружение и подсчет количества опухолевых клеток для каждого образца после их захвата на чипе.
Затем окрасьте опухолевые клетки кальцеином AM и перечислите 100 опухолевых клеток в пяти микролитрах PBS. Поместите эти клетки в один миллилитр цельного нормального образца крови. Введите эти клетки в чип и переборщите количество опухолевых клеток, захваченных на чипе с помощью зеленой иммунофлуоресценции.
Выполните перечисление in vivo, как описано, и рассчитайте эффективность захвата после захвата. Перечислите от одной до 10 опухолевых клеток без окрашивания. Поместите эти клетки в один миллилитр цельной нормальной крови.
Введите эти образцы в микрофлюидный чип и захватите опухолевые клетки. Добавьте три-пять микролитров флуоресцентного красителя в 20-30 микролитров PBS и введите этот раствор на чип с помощью шприца. Перечислите количество опухолевых клеток, захваченных на чипе с синей и зеленой иммунофлуоресценцией, чтобы определить эффективность захвата.
Затем модифицируют поверхность чипа 100 микролитрами 4%3-меркаптопропилтриметоксисилана и этанола при комнатной температуре в течение 45 минут для аффинного захвата молекулы антиэпителиальной клеточной адгезии. По окончании инкубации трижды промойте чипс этиловым спиртом. Затем добавьте 100 микролитров связующего агента GMBS и дайте ему взаимодействовать в течение 30 минут.
В конце инкубации с помощью шприца трижды промыть чип одним миллилитром ПБС. Обработайте чип 30-40 микролитрами 10 микрограммов на миллилитр нейтравидина при комнатной температуре в течение 30 минут, что приведет к иммобилизации клеток на GMBS, а затем промойте PBS, чтобы удалить избыток авидина. Модифицируйте чип тремя микролитрами антитела к молекуле адгезии эпителиальных клеток и инкубируйте в течение ночи.
Все опухолевые клетки были захвачены вокруг массива волнового чипа без каких-либо отсутствующих клеток, что указывает на высокую эффективность захвата микрофлюидного чипа. Здесь показаны опухолевые клетки, окрашенные препаратами Hoechst и Calcein AM. Здесь показаны ЦОК пациента с раком желудка, полученные с помощью небольших эллипсовых микрофильтров.
Кроме того, показаны ЦОК пациента с колоректальным раком, захваченные с помощью трапециевидных микрофильтров и излучающие как синюю, так и зеленую флуоресценцию. Высокая эффективность и жизнеспособность улавливания наблюдались у опухолевых клеток, захваченных с помощью больших эллипсовых микрофильтров. Клинический иммунофлуоресцентный анализ колоректальных ЦОК, зафиксированных на микрофлюидном чипе, определил ЦОК как DAPI-положительные, КФК-положительные, CD45-отрицательные, а лейкоциты как DAPI-положительные, CK-отрицательные, CD45-положительные.
Здесь показаны клетки колоректальных опухолей, культивируемые на чипе большого эллипса после захвата, и клетки колоректальных опухолей, захваченные на микрофильтрах большого эллипса. Этот метод модификации аптамером обеспечивает новый подход к обогащению изоляции ЦОК.
