Этот метод позволяет сравнить трансцитозные способности различных уравниваемых штаммов по поляризованным эпителиальным клеткам кишечника со зрелыми соединениями. Это относительно простая методика, не требующая широкого использования ресурсов или времени, и позволяющая исследовать важный этап в патогенезе неонатальной инвазивной болезни E.coli. Продемонстрировать процедуру будет Джош Уитли, научный сотрудник моей лаборатории.
Работая внутри шкафа биобезопасности, засевайте клетки T84 в полиэтилентерефталатные мембранные клеточные культуры Transwell. В 24 луночной пластине, предназначенной для хранения трансвелл-вкладышей, заполните нужное количество собирающих лунок одним миллилитром тканевой культуральной среды или ТКМ антибиотиками. Засейте эти вставки однократно 10-пятыми Т-84 клетками, взвешенными в 500 микролитрах ТКМ антибиотиками.
Примерно через 48 часов после посева проверьте с помощью световой микроскопии, начали ли монослои сливаться. Каждые два дня после посева измеряйте и регистрируйте трансэпителиальное электрическое сопротивление или TEER с использованием эпителиального вольта на метр OM или EVOM. Перед измерением TEER обеззаражьте электрический зонд, погружая его в пять миллилитров 70% этанола в течение 10-15 минут.
Снимите зонд, стряхните избыток этанола и дайте ему высохнуть на воздухе внутри шкафа биобезопасности в течение 10 минут. Проверьте EVOM и зонд, поместив сухой обеззараженный зонд в стерильный колодец, содержащий один миллилитр ТКМ с антибиотиками со стерильной вставкой внутри, содержащей 500 микролитров ТКМ с антибиотиками. Убедитесь, что показания EVOM меньше 200 OM. Запишите это пустое значение, чтобы использовать его в последующих расчетах сопротивления.
Извлеките зонд из пробирки ТКМ антибиотиками. Осторожно опустите зонд в первую вставку длинным электродом в коллекторном колодце. Позвольте электроду коснуться нижней части собирающего колодца, но не нажимайте вниз, так как это может нарушить эпителиальный монослой и короткий электрод внутри вставки.
Когда закончите, обеззаражьте зонд в этаноле. Вычтите пустое значение сопротивления из каждого значения, полученного от каждой вставки, содержащей ячейки T84. Затем умножьте результирующее сопротивление для каждой вставки на площадь нижней части каждой вставки, чтобы получить окончательное измерение TEER.
Как только TEER достигает 1000 OMs на квадратный сантиметр, эпителиальный монослой созревает и готов к анализу инфекции. По мере созревания TEER обеспечьте клетки свежей средой каждые один-два дня. В новой 24-луночной пластине добавьте один миллилитр ТКМ с антибиотиками в одну лунку для каждой семенной вставки.
Используя стерильные щипцы, аккуратно перенесите вставки в вновь пополненные колодцы. Замените носитель во вставках. Снимите старый носитель со вкладышей, наклонив пластину, и аккуратно извлеките носитель наконечником пипетки вдоль боковой стороны вставки.
Добавьте 500 микролитров ТКМ с антибиотиками к вставкам и визуализируйте монослой, чтобы убедиться, что он остается нетронутым. За день до эксперимента измерьте и запишите TEER. Замените среду одним миллилитром ТКМ без антибиотиков в пластине и 500 микролитрами во вставке.
Возьмите меченую 15-миллилитровую коническую трубку с пятью миллилитрами стерильного лизогенного бульона или LB и используйте стерильную смазку для прививки отвара одной колонией из одного штамма Escherichia coli. Высиживают культуру в течение ночи с ослабленным колпачком из трубки. На следующий день добавьте 250 микролитров из ночной культуры LB к 25 миллилитрам ТКМ без антибиотиков в конической пробирке объемом 50 миллилитров.
Инкубировать тюбик в течение двух часов. Измерьте TEER на каждой вставке. Запишите их как ТЕЭР в момент от T до нуля часов.
Переместите вставки в колодцы в новой пластине и замените носитель. Заполните новые сборные колодцы 500 микролитрами и вставки 400 микролитрами ТКМ без ручных антибиотиков. Храните вставки внутри инкубатора культуры тканей до момента заражения.
Через два часа удалите утренние бактериальные культуры из шейкера и центрифуги. Повторно суспендировать гранулы в ТКМ без антибиотиков. Затем используйте спектрофотометр, чтобы отрегулировать оптическую плотность или OD до 0,7 или 0,9 и дополнительно разбавить до концентрации 1 миллиона колониеобразующих единиц или КОЕ на миллилитр.
Заразите каждую вставку 100 микролитрами ОД скорректированного инокулята. Запишите время и запишите его как нулевой час времени. Поместите бактериальную суспензию inoculum в количестве КОЕ на миллилитр с помощью метода разбавления трека, покрывая 10 микролитров аликвот на квадратной пластине шнека LB.
Каждые 30 минут после прививки заполняйте новые скважины 500 микролитрами ТКМ без антибиотиков и переносите вставки в эти новые скважины. Соберите среду из использованного колодца для каждой вставки в отдельную маркированную трубку и поместите трубку на лед. Верните пластину Transwell в инкубатор между временными точками.
Для каждой вставки кратко соедините собранные носители из разных временных точек и вихрь. Нанесите собранные среды на шнековые пластины LB с использованием метода разбавления трека для количественной оценки количества бактерий трансцитозы в первые два часа эксперимента. Собирайте медиа в четыре и шесть часов.
Кроме того, через шесть часов намазывайте среду из контрольных скважин. Через шесть часов измерьте и запишите TEER. После ночной инкубации подсчитайте колонии бактерий вручную на дорожке разбавления пластин LB.
Во время пролиферации стерильных клеток Т84 ТЕЭР через монослои Т84 непрерывно растут с течением времени, превышая 1000 ОМ на квадратный сантиметр примерно через семь дней после посева. Здесь показан трансцитоз изолятов неонатальной кишечной палочки с течением времени. Сравнение средних значений трансцитоза продемонстрировало значительные различия между неонатальными изолятами E.coli один против двух через два часа после заражения.
Напротив, непатогенный штамм E.coli DH5 альфа подвергся минимальному трансцитозу. Здесь показаны результаты TEER до и после заражения двумя неонатальными клиническими изолятами E.coli с различными способностями к трансцитозным эпителиальным клеткам кишечника. Скорость и количество трансцитоза варьируются между штаммами, но TEER значительно увеличивается после заражения обоими патогенными штаммами по сравнению с неинфицированными вставками.
Последовательное выполнение измерений TEER имеет решающее значение для получения воспроизводимых результатов с помощью этого метода. Следование строгим стерильным методам, чтобы избежать загрязнения, также очень важно.
