Этот протокол предоставляет точную пространственно-временную информацию о нейроактивности. Основным преимуществом этой методики является возможность манипулировать и оценивать нейроактивность с высоким пространственно-временным разрешением. Это может быть полезно для иллюстрации патогенов нервно-психических расстройств, которые приводят к нарушениям нейронной активности.
Этот метод может быть применен для изучения нейронов, а также здоровья в других органах. Продемонстрацией процедуры будет Чжунтянь Го, аспирант нашей лаборатории. Через день после имплантации головной пластины вводите 1,32 миллиграмма на килограмм дексаметазона натрия фосфата внутрибрюшинно за час до операции, чтобы избежать отека мозга.
Под стереоскопом выполните круговую трепанацию черепа диаметром примерно два миллиметра с помощью бормашины. Чтобы уменьшить повреждение головного мозга, осторожно работайте с бормашиной с постоянным легким движением и легким давлением вниз. Удалите костные отломки несколько раз с помощью аспирационной системы.
После удаления фрагмента кости используйте искусственную спинномозговую жидкость или раствор ACSF, чтобы удалить и вымыть любой мусор, оставшийся на поверхности мозга. Повторите эту процедуру очистки несколько раз, чтобы подавить воспалительные реакции. Используя систему впрыска под давлением, установите соответствующее давление для впрыска 500 нанолитров раствора AAV через стеклянный капилляр с диаметром наконечника от 10 до 20 микрометров в течение 10 минут.
Если уровень раствора AAV в стеклянном капилляре постепенно снижается, раствор AAV вводится в мозг. Оставьте стеклянный капилляр на месте еще на 10 минут, чтобы предотвратить обратный поток. Повторите это три раза, чтобы ввести в мозг в общей сложности 1,5 микролитра раствора AAV.
Нанесите 2%-ную слабоплавкую агарозу на поверхность мозга S1 с помощью микропипетки, а затем поместите стеклянное окно над трепанацией черепа с помощью двух покровных стекол. Прижмите покровное стекло к агарозе, пока она еще жидкая. Это препятствует образованию пузырьков воздуха в агарозе.
Загерметизируйте края черепного окна стоматологическим адгезивным смоляным цементом. Чтобы откалибровать систему голографической стимуляции, поместите поверхность красного флуоресцентного предметного стекла в плоскость образца и установите микроскоп в режим визуализации в реальном времени со слабым возбуждающим светом. Запустите графический интерфейс калибровки.
mfile, проверьте панель параметров и нажмите кнопку «Сохранить». Нажмите кнопку Z-сканирования на панели первого шага, если она автоматически сгенерирует три случайных пятна в 21 различных осевых плоскостях на расстоянии двух микрометров от каждой плоскости. Переместите ползунок и проверьте живое изображение.
Найдите идеальную плоскость, в которой пятна кажутся самыми маленькими и яркими, а затем нажмите кнопку «Сохранить». Это автоматически сгенерирует смещенный сферический волновой фронт для цифровой голограммы. Нажмите кнопку «Перейти» на панели второго шага, а затем щелкните шесть точек в левом квадрате.
Проверьте живое изображение. Если есть шесть различимых флуоресцентных пятен, введите их оси X и Y в поля редактирования и нажмите кнопку «Сохранить». Это автоматически сгенерирует коэффициент точного преобразования для координации калибровки между голографической стимуляцией и системой визуализации.
Затем нажмите кнопку «Сканировать» на панели третьего шага. Он будет генерировать 441 цифровую голограмму для выполнения одноточечного сканирования по полю зрения с шагом 21 на 21. Проверяйте изображения при изменении шаблонов в списке.
Отрегулируйте мощность лазера для получения точечных изображений в динамическом диапазоне устройства визуализации. Переведите устройство обработки изображений в режим записи и нажмите кнопку «Воспроизвести». После завершения воспроизведения нажмите «Создать карту веса» на панели четвертого шага и выберите изображение с наложением.
Затем закройте окно графического интерфейса калибровки. Он автоматически сгенерирует карту веса, чтобы компенсировать несбалансированную интенсивность в каждой точке. Поместите инъецированную мышь AAV с головной пластиной под микроскоп и выполните двухфотонную визуализацию с помощью голографического микроскопа и титанового сапфирового лазера с синхронизацией режимов, настроенного на 920 нанометров с 25-кратным объективом.
Откройте коммерческое программное обеспечение для обработки изображений в режиме реального времени. Отрегулируйте напряжение детектора изображения и мощность лазера визуализации, чтобы оптимизировать яркость нейронов, экспрессирующих GCaMP8f. Захватите изображения нейронов, экспрессирующих этот белок.
Чтобы осветить определенные нейроны голографической подсветкой, запустите SLMcontrol. m скрипта. Щелкните эталонное изображение и выберите полученное изображение.
Затем нажмите кнопку «Пятно», чтобы выбрать определенные пиксели на нейронах на изображении, и нажмите кнопку «Ввод» на клавиатуре, чтобы завершить его. Чтобы обнаружить нейронную активность с высоким временным разрешением с помощью датчика изображения, установите время экспозиции, область изображения и биннинг, а затем выполните получение изображения. Поместив мышь под микроскоп и выполнив двухфотонную визуализацию, откройте коммерческое программное обеспечение для обработки изображений.
В режиме визуализации в реальном времени отрегулируйте напряжение детектора изображения и мощность лазера визуализации, чтобы оптимизировать яркость нейронов, экспрессирующих GCaMP-6m-p2A-ChRmine. Захватите изображения нейронов, экспрессирующих эти белки, а затем осветите конкретные нейроны, следуя процедуре, показанной ранее. Чтобы исследовать функциональную связь во втором и третьем нейронах слоя, используйте пространственный модулятор света для создания голографических паттернов оптогенетической стимуляции и объединения его с двухфотонной кальциевой визуализацией.
Установите интенсивность лазера визуализации на 920 нанометров при 10-20 милливаттах и поле зрения на 256 микрометров на 256 микрометров, измеренных на глубине от 100 до 150 микрометров от поверхности коры. Установите время выдержки пикселя на уровне 1,5 микросекунды для двух герц или 100 наносекунд для 30 герц. Используйте как два герца, так и 30 герц в качестве частоты кадров изображения, чтобы увидеть, вызвал ли один голографический стимул кальциевый ответ в нейронах.
Установите интенсивность голографического стимулирующего лазера, который стимулирует один нейрон, на уровне 10 милливатт, что достаточно для индуцирования нейронной активности. Одновременно визуализируйте реакцию кальция на 920 нанометров с 10 голографическими стимулами на 1040 нанометров и восьмисекундными интервалами в течение 50 миллисекунд после базового периода в 10 секунд. После этого верните мышь в домашнюю клетку.
Здесь показано репрезентативное изображение и следы нейронов, экспрессирующих GCaMP8f в изображениях с частотой 100 герц с голографической стимуляцией и датчиком изображения. На этом графике показана нейронная реакция на голографическую стимуляцию при каждой мощности лазера. Здесь представлены репрезентативные следы кальция 2+ во время голографической стимуляции 10 различных нейронов с частотой кадров изображения с двумя герцами и 30 герц.
Один и тот же цвет указывает на один и тот же нейрон. Здесь показана принципиальная схема, оценивающая функциональные связи между нейронами. Когда оранжевый нейрон стимулируется, красные нейроны реагируют одновременно, указывая на то, что между этими нейронами существует функциональная связь.
Типичное изображение первичных нейронов соматосенсорной коры, экспрессирующих GCaMP6m в диком типе, показано здесь. Эти графические изображения представляют собой типичные следы кальция 2+ во время голографической стимуляции с частотой кадров изображения с двумя герцами и 30 герц. Нейрореакция на голографическую стимуляцию может быть обнаружена как на двухгерцовой, так и на 30-герцовой скоростях.
Эти шаги важны для уменьшения движения мозга и, во-вторых, для получения стабильных результатов. Мы считаем, что этот микроскоп может индуцировать поведение в пишущих нейронах с определенными паттернами. С помощью этого метода мы теперь можем оценивать и манипулировать активностью отдельных нейронов и детально характеризовать нейропсихиатрию.
