Этот метод помогает понять, как скорость секреции изменяется со временем и как клетки реагируют на изменяющиеся во времени твердые сигналы. Основные преимущества этой техники заключаются в том, что она невысока, требует небольшой подготовки, а настройка системы изобилия может быть адаптирована для новых экспериментов. Начните с заполнения одного шприца фоновым раствором и загрузите его в первый шприцевой насос.
Наполните другой шприц трассирующим раствором и загрузите его во второй шприцевой насос. Подключите оба шприца к двум из трех портов четырехходового запорного крана с помощью разъемов luer. Закройте запорный кран к фоновому раствору и закачивайте следящий раствор в запорный кран до тех пор, пока он не выпадет из открытого порта.
Остановите насос и не регулируйте шприц дальше. Убедитесь, что движущаяся штанга шприцевых насосов прижата к плунжерам шприца, чтобы поток начался сразу же после запуска насоса. Закройте запорный кран к трассирующему раствору и перекачивайте фоновый раствор в запорный кран до тех пор, пока весь остаточный раствор индикатора не будет смыт из открытого порта.
Остановите насос и не регулируйте шприц дальше. Настройте компонент системы потока, необходимый для анализа RTD. Вставьте конец в дозатор наконечника пипетки и прокачайте фоновый раствор через компонент до тех пор, пока он не будет полностью заполнен.
Установите насос для трассирующего раствора на желаемую скорость потока. Закройте запорный кран к фоновому раствору и запустите поток трассирующего раствора. Одновременно запускаем дробный коллектор.
Продолжайте поток индикаторного раствора в течение короткого периода времени, чтобы приблизить импульсный вход индикатора. Длительность импульса 10 минут рекомендуется для RTD при скорости потока один миллилитр в час. Остановите насос индикаторного раствора в конце импульсного периода индикаторного раствора.
Быстро закройте запорный кран к трассирующему раствору и запустите поток фонового раствора с той же скоростью потока. Позвольте фоновому раствору течь и собирать фракции до тех пор, пока весь индикатор не пройдет через систему и не попадет в собранные фракции. В стерильных условиях вводят пробки с иглами в колодец пластинчатых культур с подтянутыми вверх иглами.
После того, как пробка будет на месте, опустите иглы на нужную высоту для перфузии, так как высота выходной иглы определяет стабильный уровень жидкости. Закройте иглы мужскими колпачками и держите всю пластину в инкубаторе при температуре 37 градусов по Цельсию до использования. Подготовьте два носителя для использования для перфузии, пометив среду, которая будет распределяться первой, как одну, а другую среду две.
Чтобы каждая культура была перфузирована, заполните один шприц средой, чтобы он продержался всю продолжительность его дозирования плюс достаточный объем, чтобы первоначально заполнить перфузионную систему. Наполните второй шприц средой два, чтобы продержаться весь период его дозирования. Подключите оба шприца к двум из трех портов четырехходового запорного крана.
Может потребоваться длина трубки для подключения шприцев к запорным кранам. Подготовьте запорные краны, закрыв запорный кран для среднего одного и дозируя средний второй в запорный кран, пока он не начнет капать из открытого порта. Затем закройте запорный кран для среднего два и распределите средний один в запорный кран до тех пор, пока все оставшиеся среды два не будут смыты из открытого порта.
Прикрепите трубку вверх по течению к открытому порту запорного крана с помощью гнездового разъема для барбера. Вставьте штекер в разъем barb luer на другом конце трубки. Дозируйте среду один из шприца до тех пор, пока трубка вверх по течению не будет заполнена средой, и приступайте к приготовлению трубки ниже по течению, как показано ранее.
Вставьте штекер для барб-луера в один конец трубки и закройте его женским колпачком luer. Аккуратно поднесите все подготовленные трубки, шприцы и плиту колодца в инкубатор, который будет использоваться для перфузии. Поместите шприцевой насос и дробной коллектор в нужных местах рядом с инкубатором.
Поместите шприцевой насос сверху или рядом с инкубатором и поместите дробный коллектор рядом с инкубатором рядом с портом. Загрузите шприцы в насос. Соедините вместе закрытые концы всех труб вверх и вниз по течению и протолкните их с внешней стороны инкубатора внутрь через порт.
Вставьте открытые концы последующих трубок в наконечники дозирующих пипеток многоголовочного дозатора коллектора фракций. Внутри инкубатора потяните как можно больше слабины трубок вверх по течению в инкубатор, чтобы максимизировать длину трубки, через которую текущая среда может получать тепло и углекислый газ. Для каждого закупоренного колодца быстро отсоедините иглы и трубки вверх и вниз по течению для этого колодца, а затем прикрепите их вместе с разъемами luer.
После того, как все части соединены, кратковременно запустите шприцевой насос на относительно высокой скорости, чтобы убедиться, что все потоки текут должным образом. На этом этапе, если есть желание начать эксперимент с нижестоящими трубками, полными среды, продолжайте работу насоса до тех пор, пока все не будут заполнены, в противном случае остановите насос. Установите расход шприцевого насоса для среднего и частоту сбора фракций и запустите обе машины одновременно, чтобы начать эксперимент.
Когда источник среды необходимо заменить, быстро остановите шприцевой насос для среднего. Поверните закрытый запорный кран на средний и запустите шприцевой насос для среднего двух. При желании позже переключите источник обратно на средний аналогичным образом.
Собирайте дроби на нужную продолжительность эксперимента. Концентрации индикаторов во фракциях из двух экспериментов с RTD были измерены и введены в RTD из скрипта MATLAB для получения двух RTD. Одиночные трубки и несколько кусков трубки последовательно подходят по одной осевой дисперсионной модели, а добавление перфузированной пластины из 48 скважин в линию вызвало незначительное отклонение, позволяющее как одномерному трубчатому RTD, так и RTD всей системы соответствовать функциям осевой дисперсии.
Пример плохого соответствия модели был продемонстрирован с использованием модели осевой дисперсии, установленной на данных RTD одной метровой трубки, и был построен вместе с данными. Первоначальные догадки параметров были изменены, чтобы получить хорошую модель соответствия, где тау был примерно равен объему перфузионной системы, деленному на его объемный расход. 90-минутный импульс TNF-альфа был определен как входной сигнал в систему и был свёрнут с одномерной трубкой RTD для определения сигнала TNF-альфа на входе плиты скважины.
Входной сигнал также сворачивался с RTD всей системы для определения сигнала TNF-альфа на выходе из системы в собранных фракциях. Клетки HEK 293 были спроектированы для секреции GLuc, приводимого промотором, содержащим элемент ответа NF-kappaB. Эксперимент выявил значительное увеличение экспрессии и медленное снижение экспрессии GLuc, обусловленное NF-kappaB после воздействия TNF-альфа.
Вариации системы описаны в сопроводительной статье, включая более простую настройку для экспериментов, которые не требуют ввода сигналов и воздействия на клетки соединительных профилей растворенных веществ pharma-hu.
