Наш протокол описывает метод микромоделирования с высоким разрешением для изготовления акрилового микрофлюидного устройства для количественного иммунодетекции концентраций анализируемых веществ, сопоставимых с методом ИФА золотого стандарта. Изюминкой является изготовление простого и недорогого термопластичного микрофлюидного устройства без чистой комнаты, что позволяет сократить время анализа и хорошие пределы обнаружения в количественном выражении. Начните с поверхностного шлифования.
Вырежьте прямоугольники 9 x 25 мм толщиной 1,3 миллиметра с помощью 800-микрометрового торцевого фрезерного бита. Аккуратно прикрепите один из этих прямоугольников с помощью двусторонней клейкой ленты к пьезоэлектрической платформе. Подключите и поместите Z-сенсор на поверхность прямоугольника PMMA.
Выберите контакт обнаружения и переместите его по поверхности датчика. Опустите контакт вручную, не соприкасаясь с датчиком. Активируйте режим Z-zero sensing.
Вращайте 200-микрометровый концевой фрезы со скоростью 14 500 об/мин. Медленно опустите его до начальной координаты по оси z. Затем сбросьте ось Z на 30 микрометров ниже начала координат.
Задайте эту координату в качестве нового Z-начала. Нажмите кнопку «Вырезать» в программном обеспечении микромосяческого станка, чтобы активировать режущую панель. Нажмите на кнопку Добавить и выберите TXT-файл с ранее созданным кодом для шлифования акриловой поверхности.
Нажмите кнопку «Вывод», чтобы начать процесс. Для фрезерования пятимикрометрового ограничения, во-первых, установите скорость вращения торцевого фрезерного долота на 11 000 об/мин. Затем поднимите платформу на 6,5 микрометров с интерфейсом пьезоэлектрической платформы.
Переместите концевую мельницу вдоль оси Y на 500 микрометров. Верните пьезоэлектрическую платформу к ее начальному значению по оси z с интерфейсом управления. Затем выполните фрезерование микроканалов, открыв ранее созданный файл проектирования из программного обеспечения для проектирования.
Нажмите кнопку «Печать», перейдите в меню свойств и нажмите на цветовое окно, соответствующее слою, содержащему обрабатываемый дизайн. Задайте параметры изготовления на панели инструментов. Для фрезерования отверстий переключитесь на 800-микрометровый концевой фрезы.
Активируйте конструктивный слой отверстий диаметром 1,2 миллиметра, нажав на соответствующее цветовое окно и выбрав соответствующие параметры изготовления. Обрабатывайте два дополнительных отверстия на контралатеральных углах прямоугольника для выравнивания акрила в перевернутом виде на новой платформе. Переверните акрил и заклейте его двусторонней клейкой лентой поверх адаптера с обработанными столбами.
Откройте файл с дизайном отверстий для противоположной стороны от программного обеспечения проектирования. Отшлифуйте оставшуюся половину реагента впускными и выходными отверстиями диаметром 1,5 миллиметра и глубиной 0,7 миллиметра. Обе акриловые прямоугольные листы очистить изопропиловым спиртом и промыть дистиллированной водой.
Погрузите акрил в ультразвуковую ванну на 10 минут. Высушите оба акриловых листа и приклейте их к внутренней стороне стеклянной крышки чашки Петри двусторонней лентой. Затем поместите основание стеклянной чашки Петри внутрь более крупной стеклянной чашки Петри.
Налейте один миллилитр хлороформа в основание чашки Петри и быстро поместите крышку с акриловыми листами. Немедленно добавьте дистиллированную воду к основанию большей чашки Петри до уровня крышки чашки Петри. Допустите воздействие на акрил газообразного хлороформа в течение одной минуты.
Затем наклоните чашку Петри, чтобы сломать водяное уплотнение и сразу же раскрыть чашку Петри. Для склеивания выровняйте оба акрила с хлороформом по бокам лицом к лицу и сформируйте бутерброд. Поместите акрил в пресс на два интервала по две минуты, изменив выравнивание акрила.
Затем прикрепите два-три сантиметра шланга к каждому из отверстий устройства с помощью мгновенного высыхания жидкого клея. Наполните каналы дистиллированной водой с помощью шприца. Погрузите устройство в ультразвуковую ванну на 10 минут.
Затем опорожните воду внутри каналов устройства и используйте шприц для введения 5% раствора BSA. Готовят суспензию микрочастиц железа диаметром на 7,5 мкм в 5% BSA. Инкубируйте чип и суспензию микрочастиц блокирующим раствором в течение не менее одного часа при комнатной температуре.
Далее вставляем микрочастицы в чип шприцевой иглой через выходной шланг бокового канала. Поместите чип вертикально, затем поверните чип в два шага на 90 градусов таким образом, чтобы микрочастицы были нацелены и компактны при пятимикрометровом ограничении. Запечатайте все шланги акрилового устройства теплом.
Отрежьте впускной шланг до тех пор, пока не останется всего несколько миллиметров. Наполните дозирующую иглу буфером для промывки и вставьте ее в разрезанный шланг. Дайте раствору капнуть, а затем подключите иглу к устройству.
Отрежьте выходной шланг от бокового канала, затем подключите к шприцевому насосу. Затем повторите ту же процедуру для выходного шланга основного канала. Затем прикрепите чип к магниту.
Для иммунодетекции держите промывочный буфер текучим в течение 10 минут со скоростью 50 микролитров в час. Удалите оставшийся буфер для промывки из дозирующей иглы с помощью микропипетки и добавьте 50 микролитров суспензии наночастиц. Проточите суспензию наночастиц в течение семи минут со скоростью потока 100 микролитров в час.
Затем измените расход до 50 микролитров в час и продолжайте поток еще 15 минут. Замените дозирующую иглу и протекайте буфер для стирки в течение 10 минут с той же скоростью. Удалите оставшийся буфер для промывки из дозирующей иглы микропипеткой и добавьте 100 микролитров фторогенного субстрата.
Отрегулируйте расход и временные параметры для ввода подложки, измерения флуоресценции и шага промывки. Активируйте входной поток фторогенного субстрата в течение шести минут со скоростью 50 микролитров в час. За 15 секунд до того, как поток подложки прекратится, включите флуоресценцию микроскопа.
Начните захват изображения с помощью программного обеспечения камеры микроскопа за 10 секунд до остановки подложки со временем экспозиции 1000 миллисекунд. Нажмите на кнопку Пуск нужного параметра расхода сразу после остановки промывки подложки. Выполняйте визуализацию в течение шести минут со скоростью один кадр в секунду.
Нажмите на кнопку Пуск потока промывки сразу после остановки выбранного потока измерения. Для иммуноанализа использовали конъюгированные наночастицы Лизоцима и конъюгированное вторичное антитело, конъюгированное пероксидаза хрена. Наблюдалось увеличение интенсивности флуоресценции для различных концентраций первичных антител при сравнении областей до и после ловушки, показывая, что изменение субстратной флуоресценции прямо пропорционально концентрации первичного антитела.
Для заданной концентрации первичного антитела интенсивность флуоресценции была построена как функция времени при различных скоростях потока фторогенного субстрата. Конверсионная способность субстрата ферментом HRP была обратно пропорциональна скорости потока, максимальная интенсивность была получена для скорости потока один микролитр в час. Для различных скоростей потока для различных концентраций первичных антител кривые различий флуоресценции после и до иммунореакции показали, что для концентрации 1000 нанограмм на миллилитр флуоресценция насыщает все оцененные скорости потока.
Калибровочную кривую составили с использованием максимального значения различий в интенсивности флуоресценции, полученного относительно концентрации первичного антитела для каждой скорости потока. Высокая изменчивость и высокие уровни флуоресценции при одном микролитре в час свидетельствуют о том, что скорость не благоприятствует потоку реагирующей подложки и имеет тенденцию накапливаться сразу после ловушки. Особое внимание следует уделить этапам уплотнения микроканалов, так как воздействие хлороформа очень чувствительно к температуре.
Для воспроизводимых результатов температура всегда должна быть одинаковой. Наша система помогает понять, где компактность и размер микрочастиц, размер наночастиц, антигены, антитела обнаружения и субстрат являются определяющими факторами для предела обнаружения в микрофлюидном иммуноанализе на основе наночастиц.
