Этот протокол описывает, как проводить скрининг бактерий с воздействием на устойчивость к окислительному тепловому стрессу C.elegans в двух штаммах C.elegans на 48 бактериальных изолятах параллельно. Такой подход является универсальным и масштабируемым. Он обеспечивает быстрый скрининг множественных состояний с воздействием на C.elegans против здоровья, что применимо для изучения механизмов здоровья и заболеваний.
Используя стрессоустойчивость в качестве прокси для здоровья, этот конвейер легко применим для доклинического скрининга лекарств, противорвотных средств и пробиотиков на мутантных, нокдаунных, трансгенных и болезнетворных моделях нематод. Способность параллельно тестировать многие условия позволяет изучать сложные взаимодействия и обслуживать физиологические процессы. К ним относятся взаимодействия микробов-хозяев, метаболические нарушения, обработка стресса и старение.
Очень важно избегать загрязнения во всем. Не позволяйте глистам заканчиваться пищей, и выполняйте ключевые шаги, как только черви достигнут необходимой стадии. Начните с приготовления концентрированной культуры бактерий E.coli OP50 с инокуляции четырех литровых бутылок лизогенного бульона двумя миллилитрами закваски OP50 в каждой.
Затем поместите бутылки в встряхивающий инкубатор на шесть часов при 37 градусах Цельсия и 160 Г, а затем гранулируйте бактерии при 3057 Г и 20 градусах Цельсия в течение 15 минут. После этого выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулы с шестью миллилитрами среды OP50. Собрать концентрированную культуру в стерильную коническую трубку объемом 50 миллилитров.
Прививайте восемь шестисантиметровых пластин NGM на штамм 100 микролитрами насыщенной культуры OP50, выращенной за ночь при температуре 37 градусов Цельсия на пластину. Затем держите тарелки при 20 градусах Цельсия в течение двух дней перед использованием. Затем вырежьте квадратный кусок агара размером 0,5 сантиметра с червями из недавно изголодавшейся пластины NGM с помощью скальпеля и переложите на каждую из восьми привитых шестисантиметровых пластин NGM.
Инкубируйте эти пластины при температуре 20 градусов Цельсия в течение трех дней. Затем повторно приостановите червей, добавив до трех миллилитров стерильного буфера M nine к шестисантиметровым пластинам NGM с помощью пипетки P1000, и соберите раствор червя со всех восьми пластин на штамм в одной конической трубке размером 15 миллилитров. Затем центрифугируйте в 142 раза G в течение двух минут при четырех градусах Цельсия и осторожно удалите супернатант с помощью пипетки P5000 или водяного насоса, оснащенного стерильной пипеткой или наконечником Пастера.
После этого добавьте 10 миллилитров стерильного буфера M nine, чтобы промыть гранулу червя. Затем удалите супернатант и перенесите червей на 15-сантиметровую привитую пластину NGM OP50, дополненную концентрированным OP50 с помощью пипетки. Выращивайте каждый штамм червя на пластине NGM диаметром 15 сантиметров в течение трех-четырех дней при 15 градусах Цельсия, повторно кормя червей 0,5 миллилитрами концентрированного OP50 ежедневно.
После сбора и промывки буфера M nine перенесите культуру каждого штамма червя на большее количество пластин NGM и размножайте червей при температуре 20 градусов по Цельсию, пока 95% популяции не станут гравидными взрослыми особями. Затем отбеливайте взрослых червей, следуя стандартному методу подготовки яиц, и переносите яйца на две несеянные 15-сантиметровые пластины NGM в течение 24 часов при 15 градусах Цельсия, чтобы позволить всем личинкам L one вылупиться и расти синхронно на последующих этапах. Во-первых, соберите всю бактериальную массу, ранее выращенную на шестисантиметровой агаровой пластине LB, и перенесите ее в меченую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую один миллилитр буфера M nine.
Затем вращайте трубку микроцентрифуги до тех пор, пока бактериальные гранулы не будут полностью повторно суспендированы. Затем раскрутите вниз при 9, 300 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре и удалите 700 микролитров супернатанта. Снова повторно приостановите бактериальную гранулу путем вихря.
Затем переложите 200 микролитров каждой бактериальной суспензии в одну лунку пустой стерильной пластины 96 лунок. Из этой пластины инокулируют восемь 96 хорошо NGM агарозных пластин 10 микролитрами бактериального раствора с помощью многоканальной пипетки и инкубируют с крышкой при 25 градусах Цельсия в течение 24 часов. После этого запечатайте 96-луночную подвесную пластину чистой клейкой потолочной пленкой и храните ее при температуре 15 градусов Цельсия в течение пяти дней.
Для начала оцените стадию развития синхронизированной популяции червей, взглянув на пластины. Как только более 90% червей достигнут стадии L четыре, соберите червей в до 10 миллилитров стерильного раствора M nine в конических трубках объемом 15 миллилитров. Затем тщательно промывайте червей в течение четырех раз, вращаясь в 142 раза G в течение двух минут при четырех градусах Цельсия, добавляя 10 миллилитров свежей стерильной M девять между каждой стиркой, чтобы избавиться от бактерий OP50.
Затем удаляют супернатант и повторно суспендируют червячную гранулу в 10 миллилитрах М девять. Переложите 50 микролитров раствора червя в 1,5 или два миллилитра низкоповерхностно-связывающую трубку, содержащую 950 микролитров M девять. После осторожного перемешивания содержимого трубки, чтобы избежать осаждения червей, быстро используйте смаченный наконечник пипетки с низким связыванием, чтобы перенести три-четыре отдельные 10-микролитровые капли на стеклянную горку или пластину NGM.
Под стереомикроскопом при 16-кратном увеличении подсчитайте количество червей и усредните количество от трех до четырех капель, чтобы определить количество червей на микролитр в растворе червя. Отрегулируйте концентрацию червей до 15 червей на микролитр в конической трубке объемом 15 миллилитров. Затем переложите восемь микролитров червячного раствора в каждую из скважин восьми 96-луночных агарозных пластин NGM с помощью многоканальной пипетки или повторной пипетки.
Через 36 часов дозируйте 30 микролитров M девять в каждую лунку из 96 луночной пластины. Затем перенесите червей на плиту скважины 384 в соответствии с установленными макетами с использованием наконечников с низким уровнем удержания, гарантируя, что считыватели пластины настроены правильно. После этого дополните 384 плиты скважины более девятью M, стремясь к конечному объему 60 микролитров на скважину, добавив 40 микролитров M девять для анализа теплового напряжения и 34 микролитра M девять в шести микролитрах TBHP для окислительного стресса, вызванного TBHP.
Затем начните анализ в течение двух минут после добавления TBHP. Далее закройте пластины прозрачной крышкой, а края пластин 384 скважины заклейте маскировочной лентой, следя за тем, чтобы лента не проходила через крышку или под пластину. Затем вставьте пластину в считыватель пластин.
Определите значение флуоресценции, ниже которого пик не будет существенно отличаться от шума, и обратите внимание на самый ранний момент времени, когда флуктуации флуоресценции ослабевают перед подъемом. Затем обратите внимание на временные точки, между которыми, как ожидается, упадут минимальные и максимальные значения флуоресценции, поскольку они будут использоваться для подгонки кривой. После этого проверьте, значительно ли изменяются амплитуды пиков флуоресценции между скважинами.
Нормализуйте данные перед дальнейшим анализом, используя формулу, описанную в рукописи. Сначала загрузите LFASS с GitHub, запустите MATLAB и перейдите в папку LFASS. Затем введите и запустите папку fit в командном окне, следуя инструкциям на экране.
После ввода в папку fit введите имя папки данных, в которой находится файл Excel, как Мои данные. Затем введите два для интервала времени между последовательными измерениями в текущем протоколе и введите пороговое значение шума. Затем назначьте верхний порог допуска, набрав 0,94, и нижний порог допуска, набрав 0,06, чтобы ограничить подгонку сигмовидной кишки.
Установите временные интервалы для поиска максимальных и минимальных значений. Чтобы визуально проверить сходящиеся припадки, введите Y для да или N для нет, чтобы не отображать подогнанные и плавные кривые при появлении запроса. Затем укажите новые, нижние и верхние временные границы для попытки переоборудования.
Если вы хотите попробовать переоборудование, введите два. Но если вы хотите принять переоборудование и перейти к следующей кривой, введите ноль. Чтобы выбрать, следует ли анализировать кривые, идентифицированные как шум, или переоборудовать плохо подогнанные кривые, либо тип Y одобрить, а N отклонить.
После того, как переоборудование было предпринято или отклонено для всех оставшихся кривых, программа заканчивается. Извлеките файлы результатов из папки результатов и сохраните их в виде точки XLSX для последующего анализа. Анализы устойчивости к тепловому и окислительному стрессу были проведены на двух червях дикого типа Bristol N, которые питались либо бактериальными изолятами MYB11, либо MYB115, либо контрольными бактериями E coli OP50.
Через 36 часов взрослые популяции диких червей подвергались тепловому стрессу 42 градусов по Цельсию и окислительному стрессу, вызванному TBHP, 7%. Среднее время смерти варьировалось от 40 до 130 минут для анализа теплового стресса и от 90 до 240 минут для анализа окислительного стресса. Чтобы убедиться, что черви выращены на этапе 2.5, а шаг 2.1 может занять до двух часов, нарисуйте макет пластины для подготовки червей от 96 лунок до 284 плит скважины на этапе 4.6.
Шаги могут быть добавлены или заменены. Например, широкоформатные РНК-скрининги генома хозяина или бактериальные генетические скрининги могут быть выполнены путем замены изолятов кишечных бактерий клонами RNI или бактериальными мутантами соответственно. Таким образом, в настоящее время мы используем этот подход для выявления новых пробиотиков и выявления генных регуляторных сетей, участвующих в микровзаимодействиях хозяина в контексте инфекций и старения.
