Этот протокол позволяет пользователю количественно измерять клинически аналогичные маркеры повреждения в визуализации сетчатки мыши, что укрепляет переводимость последующих результатов. Эти методы позволяют нам оптимизировать анализ и дают нам возможность надежно сравнивать изображения между экспериментальными животными. Хотя эти методы были разработаны для изучения обзора мышиной модели, они могут легко распространяться на исследования любых заболеваний сетчатки, которые используют те же методы визуализации.
Включите световой короб микроскопа для визуализации сетчатки, аппарат оптической когерентной томографии и нагретую платформу мыши. Включите компьютер и откройте программу создания образов. Добавьте по одной капле фенилэфрина и тропикамида в каждый глаз.
Вводят 100 микролитров 1% флуоресцеина внутрибрюшинного. Разместите мышь на платформе. Отрегулируйте высоту и угол наклона платформы до тех пор, пока вид глазного дна сетчатки не станет четким и сфокусированным.
Сфотографируйте глазное дно. Откройте программное обеспечение для визуализации и оптической когерентной томографии. В программе оптической когерентной томографии отрегулируйте подталкивание до 10.
Сделайте оптическую когерентную томографию, добавьте 75 микрометров дистально от ожога. Повторите для трех других квадрантов сетчатки. Переключите камеру на 488-нанометровый фильтр.
Увеличьте коэффициент усиления камеры до 5. Сделайте снимок глазного дна ровно через 5 минут после инъекции флуоресцеина. Откройте флуоресцеиновое изображение в программном обеспечении для обработки изображений.
Продублируйте изображение. Используя инструмент выделения, тщательно проследите основные сосуды. Игнорируйте любые суда, ответвляющиеся от этих судов.
На первом изображении удалите выделенную область, оставив только судно. Сохраните это замаскированное изображение. Переместите выделенную область ко второму изображению, инвертируйте выделенную область и удалите ее, изолируя фон.
Сохраните это замаскированное изображение. Откройте фоновое изображение и измерьте встроенную плотность. Откройте изображение сосудов, выберите контур сосудов, а затем измерьте среднюю интенсивность.
Разделите интегральную плотность фона на среднюю интенсивность сосудов, создав коэффициент утечки для глаза. Запишите этот коэффициент утечки для каждого глаза в экспериментальной когорте. Для дальнейшего контроля за фоном нормализуйте экспериментальные глаза до среднего коэффициента утечки неповрежденных контрольных глаз.
Откройте изображение оптической когерентной томографии в программном обеспечении для обработки изображений. Проследите границы слоя ганглиозных клеток, внутреннего плексиформного слоя, внутреннего ядерного слоя, наружного плексиформного слоя, слоя фоторецепторов и слоя RPE. Экспортируйте файлы в формате CSV.
Измерьте среднюю толщину каждого слоя и повторите для каждого глаза в экспериментальной когорте. Откройте изображение оптической когерентной томографии на изображении J.С помощью линейного инструмента измерьте расстояние, на котором верхняя граница наружного плексиформного слоя нечеткая. Измеряйте горизонтально, сохраняя широту, где начинается дезорганизация.
Рассчитайте сумму неорганизованных расстояний на изображении. Разделите длину дезорганизации на общую длину сетчатки, чтобы получить соотношение дезорганизации. Повторите измерение и расчет для получения изображений оптической когерентной томографии из трех других квадрантов сетчатки.
Возьмем среднее значение коэффициентов дезорганизации из четырех изображений оптической когерентной томографии. Это число представляет собой среднюю дезорганизацию для всей сетчатки. Повторить для каждого глаза в экспериментальной когорте.
Замаскированные изображения, используемые для расчета соотношения утечек для каждого изображения сетчатки, можно сравнить с другими и проанализировать, отделив основную сосудистую систему от других областей сетчатки. Количественная оценка флуоресцеина позволяет сравнивать тяжесть травмы и эффективность лечения, а также изучать изменения в утечке в течение времени травмы. Наблюдается разграничение слоев сетчатки на изображении OCT.
Количественная оценка толщины для каждого слоя сетчатки показывает, что начальная отечная реакция оказывает более глубокое влияние на внутренние слои сетчатки. Из анализа временного течения повреждения окклюзии вен сетчатки можно наблюдать начальный воспалительный отек слоев сетчатки и возможное дегенеративное истончение. Внутренний ядерный слой испытывает гораздо большую реакцию на первоначальную травму, но внутренний плексиформный слой демонстрирует более сильное истончение после того, как первоначальный отек стабилизировался и вернулся к исходному уровню.
Дезорганизация внутреннего слоя сетчатки проявляется исчезновением верхней границы наружного плексиформного слоя, смешивая наружный плексиформный и внутренний ядерные слои вместе. Дезорганизацию сетчатки двух экспериментальных групп сравнивали для исследования эффективности ингибитора в смягчении повреждения сетчатки. Качество изображения жизненно важно для качества анализа.
При получении изображений сетчатки потратьте время, чтобы убедиться, что слои глазного дна и сетчатки максимально четкие и сфокусированные. Эти неинвазивные методы могут использоваться продольно и в сочетании с биохимическим и иммуногистохимическим исследованием тканей для создания более многогранных и подробных профилей заболевания. Этот метод позволяет надежно количественно оценить данные визуализации сетчатки in vivo в моделях нейрососудистых заболеваний, чтобы данные можно было легче перевести в болезнь человека.
