Прозрачность роговицы играет важную роль в прояснении зрения. В патологическом контексте эта прозрачность может быть поставлена под сомнение. Изучение механизма патогенеза требует простых моделей, имеющих высокое сходство с органом человека.
В этих аспектах рыбка данио является отличной моделью. И это первое подробное описание истирания роговицы у рыбок данио. Эта техника является простым и быстрым способом вызвать поверхностный вход в глаз.
Закрытие раны можно легко проследить после истирания. Кроме того, химические вещества или определенные факторы могут быть добавлены в воду резервуара для изучения их влияния на закрытие раны. Поскольку рана создается вручную, метод требует некоторой практики для получения последовательных результатов.
Перед экспериментом подготовьте 0,02% рабочий раствор трикаина. Разморозить 2 мл 0,4% раствора. Добавьте до 40 мл системной воды.
И поместите раствор в небольшой контейнер. Приготовьте офтальмологический заусенец, проверив, чист ли наконечник заусенца. А при необходимости удалить остатки клеток влажным ватным тампоном.
Сделайте разрез в сторону мягкой губки. И смочите губку системной водой. Поместите губку на ступень рассекающего микроскопа.
Обеспечьте достаточное рабочее пространство для использования заусенца. И достаточно освещения сбоку и сверху, чтобы правильно разглядеть поверхность глаза. Осторожно поместите обезболенную рыбу ложкой в разрез на губке с головкой, выступающей из поверхности губки.
Осторожно подойдите к поверхности глаза кончиком заусенца. И начните движение кончика по поверхности глаза круговыми движениями. Когда истирание будет сделано, осторожно поместите рыбу в пресную систему воды, содержащую анальгетик для восстановления.
Очистите заусенец сразу после использования влажным ватным тампоном. Подберите рыбу в нужный момент времени и поместите ее в 0,02% раствор трикаина. Держите животное в растворе до тех пор, пока оперкулярное движение полностью не прекратится и рыба не отреагирует на прикосновения.
Поместите рыбу на чашку Петри ложкой и подержите ее пинцетом. Обезглавить рыбу рассекающими ножницами. Избегайте появления царапин на поверхности глаз.
Поместите ткань в пробирку, содержащую 0,1 М фосфата натрия. И промыть его чистым буфером, чтобы в растворе не осталось крови. Зафиксируйте ткань в 2,5% глутаральдегида в 0,1 М фосфата натрия в течение 24 часов при 4 С. Удалите фиксирующий раствор и промойте образец несколько раз 0,1 М фосфата натрия.
Рассекните образец, поместив его на каплю 0,1 М фосфата натрия на рассекающую пластину. Разрежьте образец головки на две части тонкими рассекающими ножницами. Кроме того, соберите глаза, осторожно поместив кончики тонкого пинцета в глазницы со стороны глаза.
Затем вытащите глаз из глазницы и удалите лишнюю ткань. Переложите рассеченный образец в пробирку, содержащую 0,1 М фосфата натрия. Убедитесь, что в пробирке для образцов нет лишней ткани, так как она может прилипать к верхней части глаза во время обработки образца.
Поместите крепление с помощью вкладки на держатель. И держатель к основанию рассекающего микроскопа. Аккуратно поместите образец ткани на крепление тонким пинцетом, роговицу вверх.
Покрыть образец платиной с помощью соответствующего устройства. И храните образцы при комнатной температуре до получения изображения. Получайте изображения нужного увеличения.
И используйте для анализа изображения от 2000 до 2500x. Отрегулируйте яркость и контрастность, чтобы четко видеть все границы клеток и микрориджи. И избегайте переэкспонированных областей на изображении.
Откройте изображение TIFF с помощью Fiji ImageJ 1.53. И используйте шкалу для установки шкалы. Создайте линию, равную шкале масштаба, с помощью инструмента «Линия».
Выберите Анализ. Затем установите масштаб. И набираем на известном расстоянии.
Затем откройте менеджер ROI с помощью меню Анализ, Инструменты. Для параметров Размер ячейки и округлость выберите Анализ, Задать измерения, Дескрипторы фигур. И используйте инструмент «Увеличительное стекло», чтобы увидеть ячейки под увеличением.
Выделите ячейки с помощью инструмента «Полигон» и добавьте каждый выделенный фрагмент в диспетчер окупаемости инвестиций. Наконец, измерьте выбранные ячейки и сохраните измерение. Чтобы продолжить анализ микрориджа, убедитесь, что изображение находится в 8-битном формате, нажав на меню Изображение, Тип.
Затем выделите ячейку с помощью инструмента «Полигон». И очистите фон, нажав «Редактировать», затем «Очистить снаружи». Сгладьте изображение один-три раза, выбрав Обработать, Сгладить.
И отрегулируйте яркость и контрастность от Image, Adjust, Brightness/Contrast, чтобы микрориджи выделялись как можно более четко. Сверните изображение, нажав на Процесс, Фильтры, Convolve. И превратите его в двоичный, нажав Обрабатывать, Двоичный, Сделать двоичным.
Затем скелетируйте черно-белое изображение, выбрав «Обрабатывать», «Двоичный», «Скелетонизировать». Используйте функцию Анализируемый скелет для измерения параметров микрориджа и сохранения значений. Область раны закрывается через три часа после ранения.
Но место, где соединяются границы раны, остается видимым. Результаты показали, что на истиранном эпителии роговицы микрориджи могут наблюдаться в некоторых вытянутых клетках рядом с местом раны. В некоторых периферических областях микрориджи теряются из центра клетки.
Сравнение между двумя периферическими областями показало удлиненные клетки с более короткими средними микрориджами, что указывает на клеточные перестановки как реакцию на ранение. Эти результаты свидетельствуют о том, что изменения формы клеток коррелируют с модификацией микрориджа и подчеркивают гетерогенность в эпителии роговицы в реакции раны. Помните, что операция требует тренировки для выполнения однородной и воспроизводимой раны.
Помимо электронной микроскопии, ткань может быть использована для гистологии, иммунологических окрашиваний и гибридизации in situ. Они обеспечат дальнейшее понимание клеточных и молекулярных изменений во время заживления ран. Использование рыбок данио расширяет наши знания по биологии роговицы.
Кроме того, эта модель отлично подходит для фармакологических исследований и может быть использована для лучшего понимания эволюции глаз.
