Кометный анализ широко используется для оценки генотоксичности. Наш протокол предлагает ряд методологических преимуществ по сравнению со стандартным кометным анализом. Наша технология основана на удержании стандартных комет вертикально и обработке партиями по 25 штук в специально изготовленной стойке.
Это включает в себя электрофорез, поэтому резервуар меньше, использует меньше буфера и имеет встроенное охлаждение. Удерживаемые в стойке, нежные гели на слайдах более защищены и перемещаются от раствора к раствору за 25 секунд. Используя наш протокол комет крови, исследователи могут использовать булавочный укол крови для изучения повреждений ДНК у людей, других видов и широкого спектра потенциально генотоксических воздействий окружающей среды.
Любой из различных форматов для анализа кометы, которые используют слайды микроскопа в качестве твердой опоры для кометных гелей, поддаются нашему подходу. Важнейшей частью этого метода является загрузка образцов после смешивания с агарозой LMP. Образцы должны быть загружены быстро, не образуя пузырьков и покрыты крышкой, сразу же перед затвердеванием.
Для начала подготовьте 0,6% агарозы с низкой температурой плавления в PBS и поместите ее на водяную баню при 37 градусах Цельсия. Пометьте матовый конец предварительно покрытых слайдов именем, датой и информацией о лечении с помощью постоянного маркера или карандаша. Поместите охлаждающую пластину на плоскую скамью и вставьте два замороженных охлаждающих пакета в раздвижной ящик под металлической поверхностью.
Затем поместите слайды на охлаждающую тарелку, чтобы предварительно охладить в течение одной-двух минут. Центрифугируйте и извлеките супернатант из пробирок и немедленно поместите их обратно на лед. Повторно суспендировать ячейку гранулы 200 микролитрами 0,6% агарозы с низкой температурой плавления и перемешать путем пипетки.
Затем добавьте 80 микролитров агарозсодержащих клеток на охлажденный слайд и быстро поместите на гель крышку. Дайте гелю положиться на охлаждающую пластину в течение одной-двух минут. Тем временем приготовьте 500 миллилитров рабочего раствора лизисного буфера и вылейте его в лизисную посуду.
После того, как гели сложатся, быстро снимите крышку, осторожно удерживая скольжение между большим и указательным пальцами и сдвинув крышку с геля. Затем поместите слайды внутрь держателя слайдов со всеми черными метками на слайдах, обращенных в том же направлении. Поместите держатель слайда внутрь лизисной чашки.
Закройте крышкой лизисной посуды и поставьте ее для инкубации. Осторожно извлеките носитель слайда из лизисной посуды, не нарушая гели. Аккуратно поместите держатель для горки в посудомоечную машину, предварительно загруженную ледяной двойной дистиллированной водой.
Убедитесь, что слайды полностью погружены в воду, и оставьте настройку на 30 минут. Поместите замороженный охлаждающий пакет под резервуар для электрофореза для поддержания оптимальной буферной температуры. Затем добавьте в бак рабочий раствор ледяного электрофореза и переложите в него скользящий носитель.
Ориентируйте слайды таким образом, чтобы содержащие клетки гели указывали на катод. Инкубируйте слайды в резервуаре для электрофореза в течение 20 минут, чтобы позволить ДНК расслабиться. Затем включите блок питания, чтобы выполнить электрофорез в течение 20 минут со скоростью 1,19 вольт на сантиметр.
После завершения электрофореза выключите источник питания и извлеките скользящий носитель из бака электрофореза. Дайте носителю слайда стечь на папиросной бумаге в течение 30 секунд. Затем поместите держатель слайда в тарелку, содержащую буфер нейтрализации, и оставьте его на 20 минут.
После этого поместите его в посудомоечную машину, содержащую ледяную двойную дистиллированную воду, и оставьте на 20 минут. После стирки извлеките из воды носитель для горок и дайте горкам высохнуть в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Для регидратации горок переложите держатель слайдов в посудомоечную машину, содержащую ледяную двойную дистиллированную воду, и оставьте ее на 30 минут.
Затем поместите скользящий носитель в окрашивающую посуду, содержащую 2,5 микрограмма на миллилитр раствора пропидия йодида. Закройте крышкой окрашивающего блюда и высиживайте его в течение 20 минут в темноте при комнатной температуре. После инкубации переложите носитель слайда в отдельную посуду и промыть его ледяной двойной дистиллированной водой в течение 20 минут.
Снимите с тарелки скользящий носитель и полностью высушите его в темноте, либо в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия, либо при комнатной температуре. После того, как слайды полностью высохнут, храните их в коробке для слайдов в темноте до готовности к анализу изображения. Кератиноциты человека облучали различными дозами UVA и UVB или лечили 50-микромолярной перекисью водорода, чтобы вызвать повреждение ДНК.
Оптимальное напряжение составляло 1,19 вольт сантиметра, так как оно индуцирует наиболее чувствительный ответ и наибольший процент хвостовой ДНК. Цельную кровь человека облучали различными дозами UVA и обрабатывали различными концентрациями Fpg. Высокопроизводительный анализ щелочных комет показал, что оптимальные уровни повреждения ДНК были индуцированы четырьмя единицами на миллилитры Fpg.
Клеточную линию рака яичников SK-OV-3 лечили комбинацией цисплатина и перекиси водорода. Неэкспонированные клетки не показали повреждений. Воздействие только перекиси водорода генерировало значительный средний момент оливкового хвоста по сравнению с клетками, в которых были индуцированы внутридлиновые сшивки ДНК.
После лечения 100-микромолярным цисплатином внутридлиновые сшивки ДНК увеличивались с пиком через 12 часов, после чего уровни снижались до нуля через 30 ч. Важно поместить пакет со льдом в бак электрофореза и инкубировать слайды в течение 20 минут, чтобы раскрутить ДНК перед электрофорезом. Этот шаг поможет поврежденной ДНК путешествовать по току. Запуск анализа с помощью слайдов, расположенных вертикально, позволил нам автоматизировать анализ кометы.
Кроме того, наш метод упростил анализ кометы для исследований.
