Этот протокол создан для выделения и идентификации врожденных лимфоидных клеток второй группы из слизистой оболочки носа мышей и изучения определенных эффектов и основных механизмов ILC двух при заболеваниях носа. Этот метод позволяет исследователям выделить два ILC из локального мезотелиала и выявить экспрессию поверхностного антигена с помощью проточной цитометрии. Наша методика не включает в себя сложные операции.
Тем не менее, одна важная вещь - попытаться полностью удалить плоть, прилипшую к маленьким костям, чтобы избежать воздействия других близлежащих тканей Перед началом эксперимента разместите шесть черных мышей дикого типа C57 в возрасте от 8 до 12 недель в определенных условиях, свободных от патогенов, обеспеченных стандартным лабораторным обедом и водой. Чтобы установить модель аллергического ринита, эмульгируйте 50 мкг овальбумина в 0,2 миллилитра стерильного PBS, содержащего два миллиграмма гидроксида алюминия, и внутрибрюшинно вводите 50 мкг эмульгированного овальбумина каждой мыши на нуле, семь и 14 дней. На 21-й, 22-й, 23-й, 24-й и 25-й дни интраназально вводили мышам 50 мкг овальбумина, растворенного в 30 микролитрах стерильного PBS, с последующей эвтаназией мышей через 24 часа после последнего испытания.
Замочите голову усыпленной мыши в 75% этаноле в течение пяти минут и избегайте попадания этанола во внешнюю ноздрю. Положите живот вниз на операционный стол. Отрежьте четыре зуба и по средней линии головы сделайте надрез и разрежьте кожу ножницами.
Затем удалите нижнюю челюсть, отрежьте весь нос вдоль конца неба и поместите ткань в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую пять литров ледяного PBS. С помощью ножниц и щипцов удалите плоть и мышцы, прилипшие к костям. Затем перенесите нос мыши в новую 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую пять миллилитров ледяного PBS, и промойте кости.
После второго промывания перенесите нос в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Достаточно разбить ткань и переложить ее в 15-миллилитровую пробирку, содержащую два миллилитра предварительно разогретого буфера для переваривания. Закрепите крышку и поместите трубку вертикально в орбитальный шейкер при температуре 37 градусов Цельсия и 120–150 об/мин на 40 минут.
Затем добавьте пять миллилитров ледяной среды RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, чтобы остановить пищеварение. Затем отфильтруйте содержимое через 70-микронный сетчатый фильтр для удаления твердых фрагментов. После центрифугирования фильтрата при 500 г в течение пяти минут осторожно выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в ледяной среде RPMI 1640.
Чтобы повторить центрифугирование, как показано ранее, ресуспендируйте гранулу ячейки в четырех миллилитрах среды с градиентом плотности 40%. Затем осторожно вставьте пипетку Пастера на дно трубки, чтобы добавить 2,5 миллилитра среды с градиентом плотности 80%. Центрифугируйте пробирку при 400 G в течение 15 минут при комнатной температуре с установленной скоростью ускорения и замедления ниже третьей передачи.
Перед опорожнением ячеек на границе раздела удалите верхний слой примесей, чтобы избежать потенциального загрязнения. Затем с помощью пипетки слить слой мононуклеарных ячеек на границе раздела с градиентом плотности 40% на 80% в 15-миллилитровую трубку, содержащую два миллилитра ледяного холода. Промойте клетки ледяным PBS дважды.
Соберите клетки и центрифугируйте их в течение пяти минут при 500 г при четырех градусах Цельсия. Ресуспендировать клеточный гранул в окрашивающем буфере и снова центрифугировать в течение пяти минут при 500 г. Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендировать и инкубировать клетки в 80-литровом растворе, блокирующем в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия в темноте.
Добавьте один микролитр фиксируемого жизнеспособного красителя 520 непосредственно перед добавлением в образец 20 микролитров коктейля антител для окрашивания поверхности соответствующего разведения. Кроме того, установите совпадающие антитела изотипа и флуоресценцию минус единицу в качестве отрицательного контроля. Затем промойте клетки в 500 микролитрах окрашивающего буфера центрифугированием при 500 перегрузках в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Затем ресуспендируют клеточную гранулу в 200 микролитрах окрашивающего буфера. Наконец, добавьте 50 микролитров вихревых абсолютных счетных шариков в окрашенные клетки. Взбалтывайте и подвергайте их анализу проточной цитометрии.
Мышиная модель, индуцированная яйцеклетками, разработанная для изучения роли врожденных лимфоидных клеток второй группы, показала, что частота трения носа и чихания у мышей с аллергическим ринитом была значительно выше, чем в контрольной группе. В слизистой оболочке носа здоровых контрольных мышей было идентифицировано от 2 до 3% отрицательных линий и CD 45 положительных клеток. Абсолютное количество врожденных лимфоидных клеток второй группы варьировало от 2 000 до 4 000.
Анализ проточной цитометрии показал значительное увеличение общего количества врожденных лимфоидных клеток второй группы в слизистой оболочке носа при аллергическом рините по сравнению со здоровыми контрольными мышами. Более высокая экспрессия CD 226 была обнаружена во второй группе врожденных лимфоидных клеток у мышей с аллергическим ринитом, чем у контрольных мышей. Кроме того, средняя интенсивность флуоресценции CD 226 была значительно повышена у мышей с АР.
Помните об этапах удаления плоти, прилипшей к носовой кости, установки скорости ускорения и замедления при центрифугировании среды и дренировании мононуклеарных клеток. Идентифицированные двойки ILC могут быть стендом для характеристики проточной цитометрии, отсортированной для клеточной культуры или стимулированной in vitro, что поможет изучить специфический риск двойок ILC в ткани носа. Эта процедура выделения и характеристики лимфоцитов, особенно во врожденных лимфатических клетках слизистой оболочки носа, делает этот протокол предварительным справочником для исследователей, изучающих местную иммунную среду носа.
