Быстрое пятно Гольджи для визуализации дендритного позвоночника в гиппокампе и префронтальной коре

Несмотря на то, что метод пропитки Гольджи относительно прост, у него есть некоторые сложные шаги, и неспособность сделать их должным образом приводит к клеткам, которые непригодны для анализа. Этот метод обеспечивает быструю, воспроизводимую маркировку пропитанных Гольджи нейронов. А кроме того, небольшая стандартная погрешность среднего позволяет сравнивать эксперименты.

Самая сложная часть этой техники - это вырезание секций криостата, потому что есть необычная консистенция и фиксация, и поэтому получение их на плоском слайде - это немного сложная задача, требующая практики. Во-первых, поместите небольшое количество тканевой среды на предварительно прохладный криостатный патрон. Установите мозговые блоки на криостатные патроны, слегка разморозив одну сторону блока в руке в перчатке и поместив ее на тканевую среду.

Используйте замораживающий спрей на ноже и блоке. Используйте противокатаную пластину или щетку, чтобы сохранить секцию плоской во время резки. Вырежьте 100 микрометровых срезов на криостате при минус 22 градусах Цельсия.

Оттаивайте крепление, если это возможно, с помощью горки комнатной температуры и быстро противопоставляйте ее секции. Кроме того, держите слайды в криостате, чтобы они замерзали. Переложите секцию холодными щипцами или холодной кистью для краски, а затем оттаивайте крепление.

Монтируйте три-четыре корональных секции на проседания. Очистите нож бумажными салфетками между срезами. Если нож требует дальнейшей очистки, используйте 100% этанол и высушите перед нарезкой следующего среза.

Разместите слайды в стойках, расположенных достаточно далеко, чтобы обеспечить доступ к секциям. Поместите секции в дистиллированную воду дважды в течение четырех минут, прежде чем поместить их в раствор для пропитки Гольджи на 10 минут. Отделите крышки, чтобы на секциях был размещен только один слип крышки.

Накройте стеклянные слайды большим количеством монтажного носителя, прежде чем поместить стеклянную крышку на слайд. После того, как крышка соскользнула, сухие горки помечаются на любой непористой бумаге в течение трех-пяти дней, слегка перемещая их, особенно после первого дня, чтобы избежать прилипания. Позже перенесите слайды в держатели для слайдов и, в идеале, сухие горки в течение как минимум трех недель, прежде чем рассматривать их.

Для анализа плотности дендритного отдела позвоночника в пирамидных нейронах как медиальной префронтальной коры, так и области CA1 гиппокампа, измерьте длину дендрита с помощью программы анализа изображений. Подсчитайте шипы на дендритах с помощью счетчика рук и запишите как длину, так и количество шипов. Для анализа выбирают нейроны с клеточными телами и дендритами во время оплодотворения, а также дендриты, которые являются непрерывными и отличимыми от соседних клеток.

На рисунке показаны примеры пропитанных Гольджи клеток в области CA1 гиппокампа, показанных при низкой и высокой мощности. Рисунок иллюстрирует эксперимент, в котором базальная плотность дендритного позвоночника была увеличена на пирамидальных клетках у подростков мужского и женского пола крыс после обогащения окружающей среды в CA1 и медиальной префронтальной коре. При резке сложно держать секции достаточно холодными, и для этого мы используем много морозильного спрея.

И впоследствии, трудно вытащить секции на горки и сделать их сухими плоскими. Этот метод используется для изучения нейроанатомических характеристик. Его можно использовать отдельно или в сочетании с другими нейроанатомическими методами трассировки.