Протокол одновременно отслеживает реакцию бактериального роения на различные концентрации индуктора на полутвердом агаре. Это достигается экономически эффективным способом. Этот высокопроизводительный метод скрининга сводит на нет необходимость использования агара с различными концентрациями индукторов для наблюдения за микрохемотаксическими реакциями.
Методика предназначена для скрининга лекарств, а также для наблюдения за реакциями микропатогена SD. Также его можно использовать для изучения микроответов на различные биохимические сигналы у человека-хозяина. Этот метод может дать представление о бактериальном хемотаксисе.
Бактерии будут реагировать на различные концентрации химических аттрактантов, известных как положительный хемотаксис или химические репелленты, известные как отрицательный хемотаксис. Тщательно подготовленная настройка необходима, чтобы избежать изменений между гелевым углом нижнего слоя, чтобы предотвратить проблему воспроизводимости. Для начала наклейте 13 на 13 сантиметров квадратные чашки Петри с пятнами и индукторными названиями.
Затем подпирайте посуду через край крышек. Добавить раствор арабинозы в теплый нижний слой среды. Добавьте 40 миллилитров теплой среды нижнего слоя.
Дайте среде нижнего слоя отверждаться непокрытой в течение одного часа внутри ламинарной вытяжки без помех. Как только нижний слой полностью затвердеет, снимите крышки и положите чашки Петри внутрь ламинарной вытяжки. Добавьте 40 миллилитров теплой среды верхнего слоя с помощью моторизованного пипеточного фильтра.
Отвержьте двухслойные пластины, покрытые и нетронутые в течение одного часа, затем храните их при четырех градусах Цельсия в течение 24 часов. Поместите маркированную бумагу формата А4 под хорошо затвердевшую градиентную пластину. Протолкните более широкую сторону наконечника пипетки объемом 100 микролитров на поверхность полутвердой среды в отмеченном положении и нажимайте на кончик пипетки до тех пор, пока он не достигнет нижней части среды верхнего слоя.
Когда наконечник коснется дна, прекратите прикладывать любую вертикальную силу к наконечнику и осторожно поверните наконечник, чтобы изолировать содержимое цилиндрического колодца. Горизонтально переместите наконечник пипетки на небольшое расстояние, чтобы обеспечить воздушный поток в узкое отведенное место. Нажмите указательным пальцем на кончик, чтобы заблокировать поток газа внутри кончика.
Вытяните наконечник вертикально, удерживая содержимое колодца в наконечнике, вытаскивая его наружу. Добавьте 80 микролитров культуры ночного роста в каждую лунку. Вынимайте роевые пластины из инкубатора по одному каждые 12 часов и помещайте их в систему визуализации геля.
Выберите режим визуализации геля, подвергните пластину роя воздействию белого света и отрегулируйте фокусное расстояние, чтобы получить четкое представление о роях. Увеличьте яркость роев для точного наблюдения, регулируя время экспозиции до 300 миллисекунд. Отрегулируйте пороговое значение, чтобы свести к минимуму помехи от фонового света.
Сохраните файл изображения для дальнейшего анализа. Запишите время обработки изображений, тип индуктора, ориентацию градиента и деформации в txt-файле. Нажмите «Обработать», затем «Тени», чтобы повысить резкость изображения.
Нажмите «Процесс», а затем «Пакет», чтобы обработать изображение. Затем обработайте изображение в качестве ссылки, щелкнув «Процесс», «Тени» и «Юг». Щелкните Обработка, Пакет, Макрос, чтобы открыть окно Пакетный процесс.
Найдите команды, отображаемые в окне. Введите адрес папки исходных изображений в адрес выходного файла, щелкнув Обработать в окне Пакетный процесс. Используйте инструмент трассировки палочек для выбора роев по отдельности и дважды щелкните инструмент трассировки палочек, чтобы настроить допуск до тех пор, пока сгенерированная линия не будет правильно соответствовать границе роя.
Нажмите «Анализировать», затем «Измерить», чтобы экспортировать значение области. E.coli K12 YdeH был протестирован на арабинозных градиентных пластинах, используемых для демонстрации процесса роения поверхности с перекрытием, происходящим между соседними скважинами. Плита с тремя испытательными скважинами позволила сформировать неперекрывающиеся границы.
P.aeruginosa PAO1 YdeH роевая подвижность способствовала повышению концентрации арабинозы от самой низкой концентрации, но постепенно ограничивалась более высокими концентрациями арабинозы. Штаммы дикого типа E.coli K12, протестированные на пластинах градиента ресвератрола в диапазоне концентраций от нуля до 400 микролитров, показали умеренное ограничение подвижности роя с увеличением концентрации ресвератрола. Области роя были количественно определены программным обеспечением ImageJ.
Кривая роения отображала множественные реакции концентрации. Наиболее важной частью этой процедуры является изготовление двухслойной роевой пластины с определенным диапазоном концентраций индукторов. Этот метод позволяет исследователям исследовать индуцированное поверхностное роение в определенном диапазоне концентраций и количественно оценивать влияние других индукторов и компонентов на роение.
