Это слово описывает анализ дыхания при обработке митохондрий скелетных мышц мыши. Этот протокол значительно сокращает время очистки и позволяет обрабатывать несколько образцов одновременно. Митохондрии животных любого восьми пола объединенного происхождения могут быть изуродованы с помощью этого протокола, позволяющего изучать дыхание в самых разных экспериментальных условиях.
Этот метод подходит для всех областей исследований, где функция митохондрий актуальна, включая старение, тестирование лекарств, рак или развитие. Он может быть даже адаптирован к другим тканям и организмам. Убедитесь, что все материалы холодные, поместив все на лед во время процедуры, чтобы защитить митохондрии от повреждений.
Поместите на лед три стакана по 50 миллилитров на образец и добавьте 10 миллилитров PBS в стакан один, 10 миллилитров 10 миллимоляров EDTA PBS в стакан два и четыре миллилитра IB1 в стакан три. Распылите на правую заднюю конечность усыпленной мыши 70% этанолом, чтобы предотвратить выпадение меха, и приклейте конечность к пробковой рассеченной доске, а затем заклейте левую переднюю конечность. Сделайте разрез стерильным одноразовым скальпелем через кожу с колена до ног.
Обхватите кожу зубчатыми щипцами на уровне лодыжки и разрежьте ее тонкими ножницами вокруг лодыжки. Освободите кожу от подлежащей мускулатуры с помощью тонкого пинцета в одной руке, одновременно подтягивая ее зубчатыми щипцами в другой руке. Рассекните все скелетные мышцы от лодыжки до колена и удалите всю соединительную ткань над передней мышцей большеберцовой кости с помощью тонкого пинцета и ножниц.
Найдите четыре дистальных сухожилия мышцы-разгибателя digitorum longus и разделите их близко к их вставкам в пальцах ног. Найдите переднее дистальное сухожилие большеберцовой кости и обрежьте его близко к его вставке ниже лодыжки. Потяните передние и разгибательные сухожилия digitorum longus выше лодыжки, чтобы освободить свободные концы.
Захватите свободные концы сухожилий и ослабьте мышцы от остальной мускулатуры в костях, подтянув их вверх. Отрежьте проксимальные сухожилия этих мышц как можно ближе к коленной чашечке. Переверните мышь вверх дном, чтобы продолжить извлечение икроножных и камбаловидных мышц.
Захватите карман, образованный между бицепсом, феморисом и икроножной мышцей, и разделите эти мышцы, используя тонкие ножницы для визуализации проксимального сухожилия икроножной мышцы. Схватите и аккуратно срежьте дистальное ахиллово сухожилие тонкими ножницами. Отрежьте проксимальное сухожилие икроножной мышцы, освободив его с помощью подстилающей камбалы.
Осторожно рассекните оставшиеся мышцы и повторно закрепите мышь в исходном положении, чтобы рассекнуть четырехглавую мышцу. Отбросьте жировую ткань, затем вставьте тонкий пинцет между квадрицепсами и бедренной костью, чтобы отделить мышцу от кости. Захватите дистальные сухожилия четырехглавой мышцы и срежьте сухожилие как можно ближе к коленной чашечке.
Потяните квадрицепсы вверх и освободите их тонкими ножницами при проксимальном введении. Повторите то же самое для левой задней конечности. Промыть все мышцы стаканом одну, затем две, затем стакан три.
Наконец, измельчите все мышцы в стакане три острыми ножницами на льду. Перенесите суспензию на трубку С, плотно закройте ее и прикрепите вверх ногами к втулке гомогенизатора. Разделите гомогенат на две предварительно охлажденные микроцентрифужные трубки по 2 миллилитра и центрифугу в течение 10 минут.
Затем перенесите супернатант в новые предварительно охлажденные трубки и центрифугу еще на 10 минут. Объедините гранулу в 500 микролитров IB2 Перенесите супернатант в новую 2-миллилитрную предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку и пометьте его как супернатант номер два, или SN2. Re приостановить конечную митохондриальную гранулу в 200 микролитрах буфера re-суспензии.
Быстро отложите 10 микролитров для количественной оценки белка и немедленно добавьте 10 микролитров 10% FFA BSA к оставшейся митохондриальной суспензии, чтобы предотвратить повреждение. Центрифугируйте концентрированную митохондриальную суспензию в 10 500 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Суспендировать митохондриальную гранулу в 100 микролитрах 1X связующей пробирной среды с BSA, 1X среды для анализа потока электронов с BSA или среды бета-окисления 1X с BSA, в зависимости от протокола, который будет выполнен.
Разбавьте этот концентрированный митохондриальный образец до 0,2 мкг на микролитр, используя соответствующую пробирную среду. Посейте 50 микролитров суспензии на лунку в предварительно охлажденную 24-луночную микроплиту на льду. В фоновые коррекционные колодцы добавляют только соответствующую пробирную среду.
Храните оставшуюся митохондриальную суспензию при минус 80 градусах Цельсия для определения чистоты фрагментации. Раскрутите микропластинку в предварительно охлажденной подготовительной центрифуге в течение 20 минут. А пока подогрейте оставшуюся пробирную среду до 37 градусов по Цельсию.
После центрифугирования оставьте микропластинку на скамейке на пять минут, чтобы уравновесить. Медленно и осторожно добавляйте 450 микролитров теплой пробирной среды на лунку, чтобы избежать отсоединения митохондрий. Поместите микропластину немедленно в прибор для измерения потребления кислорода без крышки и запустите программу измерения.
Убедитесь, что первым шагом является 10-минутная инкубация, чтобы микропластинка прогрелась. Как только эксперимент будет завершен, извлеките картридж и микропластину, выключите прибор и начните анализ. Общие профили белков из различных фракций, полученных путем серийных центрифугирования, показали различные белковые популяции в изолированных фракциях.
Наличие всего митохондриального содержимого проявляется по сильным сигналам для маркеров внешней и внутренней митохондриальной мембраны и нуклеоидных ассоциированных белков. Фракция N представляет собой ядра и неразрушенный материал. Большинство эндоплазматических ретикулумов, плазматической мембраны или маркеров цитоплазмы во фракциях SN1 или SN2 подчеркивают высокую чистоту, полученную при выделении.
Увеличение потребления кислорода наблюдалось после добавления АДФ в анализы связи и бета-окисления. После добавления карбонилцианида-п-трифторметоксифенилгидразона потребление кислорода достигло самого высокого уровня. Низкий коэффициент контроля дыхания обеспечивает целостность изолированных митохондрий.
Анализ потока электронов исследовал активность комплексов электронной транспортной цепи по отдельности или в комбинации путем инъекции конкретных субстратов и ингибиторов. Изоляция митохондрий чрезвычайно чувствительна. Следовательно, все шаги после смягчения тканей должны выполняться усердно и осторожно, чтобы сохранить их жизнеспособность.
Экспериментальные анализы могут дополняться детерминированным сематическим анализом ключевых молекул митохондрий или исследованием сборки респирометрических комплексов с использованием электрофореза синего нативного полиакриламидного геля.
