Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы воспроизвести большинство основных аспектов болезни Паркинсона на животной модели. Стереотаксическая доставка аденоассоциированных вирусных векторов, кодирующих синуклеин человека в черной субстанции. Болезнь Паркинсона является нейродегенеративным расстройством, которое включает в себя гибель дофаминергического нейрона в нигростриатальном пути и, следовательно, прогрессирование потери контроля над произвольным движением.
Этот нейродегенеративный процесс сопровождается отложением белковой совокупности в головном мозге, которая в основном состоит из синуклеина. Новые данные показали, что агрегаты синуклеина могут стимулировать толл-подобные рецепторы на микроглии, тем самым вызывая нервное воспаление в черной субстанции. Кроме того, данные указывают на то, что агрегаты синуклеина могут быть захвачены и представлены антигенпрезентирующими клетками Т-клетками, вызывая адаптивный иммунный ответ, специфичный для синуклеина.
Стереотаксическая доставка аденоассоциированных вирусных векторов, кодирующих синуклеин человека в черной субстанции, показала, что воспроизводит многие существенные аспекты заболевания, включая патологию синуклеина, активацию микроглии, активацию Т-клеток, нейродегенерацию и двигательные нарушения. В этом исследовании представлен анализ того, как вирусный вектор и время после доставки вирусного вектора влияют на степень экспрессии синуклеина человека, нейродегенерации и нейровоспаления в нигростриатальном пути, а также на степень двигательных нарушений в мышиной модели односторонней стереотаксической доставки синуклеина человека в черной субстанции. Чтобы поддерживать асептическую среду, носите соответствующую хирургическую одежду в течение всей операции, включая бахилы, хирургические маски, гигиенический барьер, перчатки и хирургический колпачок.
Распылите этанол на мышь и весь хирургический материал, для поддержания асептической среды. Чтобы вызвать анальгезию, вводите карпрофен подкожно каждые 12 часов, начиная за час до операции и продолжая до трех дней после операции. Чтобы обезболить мышь, поместите животное в индукционную камеру.
Откройте поток изофлурана со скоростью 0,5%, а затем медленно увеличивайте его до 5% в течение примерно пяти минут, пока мышь не потеряет свой корректирующий рефлекс. Извлеките животное из индукционной камеры. Немедленно переведите животное в недыхающую цепь с носовым конусом соответствующего размера.
Поддерживайте мышиную анестезию, с изофлураном 1% на протяжении всего времени операции. Убедитесь, что мышь полностью обезболена, зажав хвосты и лапы. Когда мышь не реагирует при защемлении хвоста и лап, это означает, что мышь полностью обезболена.
Побрить головку мыши ножницами. Очистите кожу мыши ватным тампоном с хлоргексидином 2% и удалите все волосы. Зафиксируйте головку мыши в стереотаксической рамке.
Поместите протектор роговицы в оба глаза мыши, используя ватный тампон. Чтобы предотвратить индукцию стресса у других грызунов, избегайте присутствия любой другой мыши в операционной. Очистите голову мыши тремя раундами хлоргексидина 2% с последующим этанолом 70% Обнажите череп с помощью хирургического материала и сделайте тонкое отверстие с дрелью в координатах переднезадней 2,8 мм и медиолатеральной 1,4 мм, относительно медиальной линии.
Поместите иглу 10-микролитрового шприца в отверстие и медленно перемещайте иглу внутрь мозга, пока не достигнет 7,2 мм дорсовентральной, относительно твердой мозговой оболочки. Оставьте иглу в конечном положении на две минуты, чтобы ткань немного осела, а затем введите один микролитр вирусных векторов в правую черную субстанцию со скоростью 0,2 микролитра каждые 30 секунд. Оставьте иглу в том же положении в течение пяти минут после доставки вирусных векторов, а затем медленно вынимайте ее.
Закройте рану стерильным шелковым швом. Поместите мышь в домашнюю клетку, предварительно согрейте, положив ее на электрический теплый матрас. Через 12 недель после стереотаксической операции оцените двигательные характеристики, используя упрощенный вариант лучевого теста, описанный ранее.
Для этого используют горизонтальную балку длиной 25 см и шириной 3 см. Поверхность балки должна быть покрыта металлической сеткой с квадратами в один сантиметр, и приподнята на один сантиметр над балкой. Сделайте видео мыши, пересекая поверхность сетки балкой, с одного конца до противоположного конца балки, где расположена домашняя клетка.
Тренируйте мышь в течение двух дней, прежде чем определить двигательные характеристики. В первый день приучите мышь ходить по лучу пять раз, без сетки. На второй день приучите мышь ходить по лучу, в присутствии сетки пять раз.
На третий день оцените работоспособность двигателя. Для этого количественно оцените количество ошибок, выполненных, левыми лапами или правыми лапами отдельно, просматривая видео в замедленном режиме. Чтобы обезболить мышь, вводят смесь кетамина и ксилазина внутрибрюшинно.
Как только мышь будет полностью обезболена, откройте грудную клетку хирургическим материалом и обнажите сердце. Затем вставьте иглу с плоским кончиком в левый желудочек сердца. Соединив иглу с трубой, перфьюируйте 50 миллилитров фосфатного буферного физиологического раствора со скоростью 9,5 миллилитра в минуту с помощью перистальтического насоса.
Извлеките мозг ножницами и пинцетом, а затем зафиксируйте его погружением, в пять миллилитров 4%-го параформальдегида, в фосфатном буферном физиологическом растворе. После этого поместите неподвижный мозг, в 15 миллилитров 30% сахарозы в течение 48 часов. Затем поместите мозг в четыре миллилитра криопротекторного раствора, и сохраните мозг при 80 градусах, или используйте его сразу на следующем этапе.
Для получения стриатальных срезов разрежьте мозг на участки толщиной 40 микрометров, начиная с 1,34 мм, и заканчивая 0,26 мм. Собирайте каждый кусочек в двух миллилитрах криотрубы, следуя переднезаднему порядку. Для проведения иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного анализа в полосатом теле выбирают пять корональных полосатых срезов, взятых через равномерные промежутки времени, которые охватывают всю рострокодальную протяженность ядра.
Чтобы подтвердить правильную доставку вирусных векторов в дофаминергические нейроны нигростриатального пути, векторы, кодирующие GFP, были введены в черную субстанцию, а через 12 недель флуоресценция GFP и иммунореактивность тирозингидроксилазы были проанализированы в черной субстанции и полосатом теле иммунофлуоресценцией. GFP-ассоциированная флуоресценция, располагалась исключительно в ипсилатеральном участке, и значительная колокализация с тирозингидроксилазной иммунореактивностью наблюдалась как в черной субстанции, так и в полосатом теле, что указывает на правильную доставку вирусных векторов в дофаминергические нейроны нигростриатального пути. Для проверки дозы векторов, кодирующих необходимый синуклеин, чтобы вызвать значительную сверхэкспрессию синуклеина человека, способствующего нейродегенерации нигральных дофаминергических нейронов, вводили разные дозы векторов.
А через 12 недель иммунореактивность синуклеина человека и степень иммунореактивности тирозингидроксилазы были протестированы в нигростриатальном пути. Иммунореактивность синуклеина человека была очевидна, причем все дозы тестировались в черной субстанции. Однако только мыши, получавшие от 10 до 10 вирусных геномов на мышь, имели очевидную иммунореактивность синуклеина человека в полосатом теле.
Мыши, получавшие от 10 до 10 вирусных геномов на мышь векторов, кодирующих синуклеин человека, демонстрировали значительную потерю дофаминергических нейронов в черной субстанции. Хотя мыши, получавшие одинаковую дозу векторов, кодирующих GFP, демонстрировали низкую степень потери нейронов, у этих мышей наблюдалась значительно более низкая степень нейродегенерации, по сравнению с теми мышами, которые получали векторы, кодирующие человеческий синуклеин. С помощью лучевого теста значительное снижение двигательных характеристик было обнаружено исключительно у тех мышей, которые получали от 10 до 10 вирусных геномов на мышь векторов, кодирующих синуклеин человека, при сравнении количества ошибок, допущенных правой и левой лапами, или при сравнении общего числа ошибок мышей, получавших векторы, кодирующие синуклеин человека, с теми мышами, которые получают контрольный вектор.
Чтобы определить начало экспрессии синуклеина человека, мышей лечили от 10 до 10 вирусных геномов на мышь, векторов, кодирующих человеческий синуклеин, или фиктивной хирургии, и степень экспрессии синуклеина человека анализировали в черной субстанции один раз в неделю в течение двух-пяти недель после стереотаксической операции. Результаты показывают, что экспрессия синуклеина у человека начала проявляться на пятой неделе после стереотаксической операции. Чтобы определить пик активации микроглии, степень клеток, экспрессирующих высокий уровень Iba1, была количественно определена в полосатом теле мышей в течение 2-15 недель после операции.
Результаты показывают значительное увеличение активации микроглиальной стороны ипсилатеральной стороны, по сравнению с контралатеральной стороной мышей, через 15 недель после вирусной инокуляции. Количество регуляторных Т-клеток, инфильтрированных в субстанциальную нигру, анализировали в разные моменты времени, после стереотаксической хирургии иммунофлуоресценцией с последующим наблюдением конфокальной микроскопии. Пик регуляторной инфильтрации Т-клеток в черную субстанцию наблюдался на 11 неделе после операции.
Мышиная модель нейродегенерации, проанализированная здесь, представляет собой полезную модель для изучения числа ключевых аспектов участия в патофизиологии болезни Паркинсона. Механизмы вовлечения, участвующие в патологии синуклеина, активации микроглии, вовлечении периферической иммунной системы, в нейровоспаление и механизмах нейродегенерации Правильная доза аденоассоциированного вирусного вектора, подтипа пятого кодирующего синуклеин человека для индуцирования нейродегенерации, нейровоспаления, инфильтрации Т-клеток и двигательных нарушений, составляет от 10 до 10 вирусных геномов на мышь. Это исследование показывает, что пять недель после стереотаксической операции представляют собой ключевой момент времени, в котором экспрессия синуклеина человека уже была очевидна, но при отсутствии двигательных нарушений в этой животной модели.
Таким образом, эта временная точка представляет собой интересную временную точку, чтобы начать введение экспериментальных методов лечения, предназначенных для остановки прогресса нейровоспаления и нейродегенерации. Наиболее подходящей временной точкой для анализа нейровоспаления на этой животной модели является 15-я неделя после стереотаксической операции. В то время как правильная временная точка для анализа инфильтрации Т-клеток в центральную нервную систему.
по-видимому, находится на 11 неделе после посева вирусных векторов.
