Это простой и визуализированный протокол, который демонстрирует работу с органоидами аденокарциномы пищевода в двух различных субкультурных процессах с одноклеточным пищеварением и без него. Стандартизированный протокол субкультурирования органоидов EAC двумя различными методами может помочь исследователям в выборе подходящих методов для различных последующих приложений в их экспериментах на основе EAC PDO. При работе с PDO важно обращать внимание на детали на каждом этапе.
Командная СОП имеет решающее значение для качества POD. Продемонстрировать процедуру будут один из наших аспирантов Нин Бо Фан и Лиза Раатц, ассистент лаборатории. Предваряют 12-луночную плиту путем ночной инкубации при температуре 37 градусов Цельсия с использованием углекислого газа.
Если доступно, используйте пустые колодцы из тарелки с органоидной культурой, полученной от пациента. Инкубируйте соответствующий объем геля ECM в течение одного часа на льду для разжижения. Поместите раствор для восстановления клеток на лед.
Снимите пластину с растущими PDO из инкубатора. Аспирировать старую среду с помощью вакуумного насоса. Добавьте в скважину 500 микролитров на купол раствора для восстановления ледяных клеток.
Распадайте гель ECM путем пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы раздробить купола геля ECM на небольшие кусочки, используя 1000 микролитровых наконечников с широким отверстием. Объедините PDO, гель ECM и раствор для восстановления клеток максимум из двух лунок и переложите его в пятимиллилитровую трубку с низким связующим звеном. Высиживайте эту трубку на льду в течение 20 минут.
Перемешивать каждые пять минут, перевернув трубку. Центрифугируйте трубку со скоростью, в 500 раз превышающей G, в течение четырех минут при четырех градусах Цельсия. Если видимой гранулы нет, осторожно удалите супернатант вакуумным насосом до тех пор, пока не будет достигнута фаза, содержащая раствор PDO геля ECM, и добавьте три миллилитра раствора для восстановления ледяных холодных клеток.
Переверните трубку несколько раз и высиживайте на льду еще 10 минут. Центрифуга в 500 раз G в течение четырех минут при четырех градусах Цельсия. Осторожно выбросьте супернатант с помощью вакуумного насоса или пипетки объемом 1000 микролитров.
Постарайтесь удалить супернатант как можно больше. Храните гранулы PDO на льду. Снимите предварительно охлажденные 201 000 микролитровые наконечники с широким отверстием из морозильной камеры минус 20 градусов по Цельсию и поместите их на чистую скамейку.
Рассчитайте 50 микролитров ECM-геля на купол, запланированный к посеву, плюс 50 микролитров дополнительно. Затем повторно суспендируют гранулу в геле ECM с использованием предварительно охлажденного наконечника 1000 микролитров и перемешивают, пипетируя вверх и вниз около 10 раз. Снимите предварительно нагретую 12-луночную плиту из инкубатора перед посевом куполов.
Засейте купола, содержащие 50 микролитров геля ECM, в теплую тарелку. Инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 20-30 минут, чтобы затвердеть гель ECM. Добавьте предварительно нагретую среду PDO осторожно, не нарушая купола.
Мониторинг засеянных PDO под микроскопом. Культивируйте PDO в течение 7-14 дней до тех пор, пока не произойдет необходимая плотность и морфология. Подготовьте среду для пищеварения, смешав два миллилитра 0,25% трипсина ЭДТА и 20 микролитров ДНК I для переваривания PDO, собранных из двух скважин.
Повторно суспендируют ранее приготовленную гранулу в соответствующем объеме предварительно нагретых 0,25% трипсина ЭДТА и ДНК I и смешивают ее около 10 раз путем пипетки вверх и вниз с использованием пипетки 1000 микролитра. Инкубировать в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия во вращающемся инкубаторе со скоростью вращения не менее 28 об/мин. Приготовьте 15-миллилитровую трубку, содержащую шесть миллилитров раствора ингибитора трипсина сои.
После пищеварения тщательно перемешайте переваренные PDO несколько раз с пипеткой 1000 микролитров, чтобы нарушить PDO. Переведите переваренные PDO в 15-миллилитровую трубку, содержащую раствор SDI, чтобы остановить пищеварение. Центрифуга в 500 раз G в течение четырех минут при четырех градусах Цельсия.
Осторожно выбросьте супернатант с помощью вакуумного насоса или пипетки объемом 1000 микролитров. Повторно суспендировать гранулу в одном миллилитре базальной среды. Определите концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью автоматизированного счетчика клеток или гемоцитометра.
Рассчитайте количество ячеек в соответствии с куполами, запланированными к посеву, плюс один дополнительный купол и перенесите их в свежую 1,5-миллилитрную трубку с низким связующим звеном. Центрифуга в 500 раз G в течение четырех минут при четырех градусах Цельсия. Осторожно выбросьте супернатант, используя пипетку объемом 1000 микролитров.
Добавьте соответствующий объем геля ECM в гранулу, используя предварительно охлажденный наконечник отверстия шириной 1000 микролитров. Перемешайте, пипетируя вверх и вниз около 10 раз. Посейте переваренные PDO в 12-луночную пластину, как показано ранее.
Запустите процесс криоконсервации непереваренных ПДО с предварительно приготовленными гранулами. Используйте 500 микролитров холодной морозильной среды, чтобы повторно суспендировать гранулу с двух куполов и перенести ее в криогенный флакон. Заморозьте PDO на ночь в морозильной камере, используя соответствующий контейнер для замораживания клеток.
Переложите замороженные PDO в морозильную камеру с температурой минус 150 градусов по Цельсию. Для криоконсервации переваренных PDO перенесите клетки в свежую 1,5-миллилитрную трубку с низким связыванием. Центрифуга в 500 раз G в течение четырех минут при четырех градусах Цельсия.
Осторожно выбросьте супернатант, используя пипетку объемом 1000 микролитров. Повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитров морозильной среды и переложите ее в криогенный флакон. Заморозьте PDO на ночь в морозильной камере с температурой минус 80 градусов цельсия, используя соответствующий контейнер для замораживания ячеек, и переложите их в морозильную камеру при температуре минус 150 градусов Цельсия для длительного хранения.
Субкультура без одноклеточного пищеварения занимает меньше времени для достижения сопоставимой плотности и в основном приводит к компактным структурам. Напротив, одноклеточные переваренные PDO показывают структуры с полым ядром. На рисунке показано окрашивание гематоксилиновым эозином и иммуногистохимическое окрашивание парафиновых ВАК КПК с компактными и полыми структурами.
Панцитокератин позволяет идентифицировать эпителиальные опухолевые клетки. Цитокератин 7 выделяет железистые дифференцированные опухолевые клетки. Компактная структура преимущественно существует в непереваренной культуре, в то время как полая структура доминирует в культуре, которая подверглась одноклеточному пищеварению.
Ki67 выделяет клеточные популяции с более высокой клеточной пролиферацией. Ki67 в красном цвете и PanCK в зеленом были аналогичным образом распределены между первичной тканью EAC, компактной структурой EAC PDO и полой структурой EAC PDO. На рисунке показаны морфологические характеристики ПДО ЭАК в первый день восстановления из замороженного сырья с одноклеточной криоконсервацией и непереваренной криоконсервацией на основе PDO.
Рекомендуем заранее составить четкий план субкультуры. Контроль температуры и бережное пипетирование необходимы для правильного обращения с гелями ECM при субкультурной обработке PDO. Наш протокол предоставляет исследователям существенную возможность поддерживать свои PDO EAC в соответствии с их целью исследования для последующего анализа, такого как скрининговый анализ лекарств, проточная цитометрия или гистологический анализ.
Мы надеемся, что наша работа может помочь исследователям органоидов принимать быстрые и простые решения для хранения и субкультуры органоидов, особенно для надежных результатов материалов, полученных от пациентов, в трансляционных исследованиях.
