Этот подробный протокол описывает высокоэффективный и экономически эффективный метод экспрессии бактерий для рекомбинантного каталитического домена MMP-3 в E.Coli, который может быть применен к другим терапевтическим мишеням MMP. E.coli не имеет сложной системы сворачивания белка и посттрансляционной обработки. Этот метод использует штамм клеток R2DP для усиления экспрессии эукариотического белка в E.coli.
Перепроизводство специфических MMP приводит к нескольким заболеваниям, таким как рак, сердечно-сосудистые и нейродегенеративные заболевания. Активные растворимые ММП необходимы для разработки терапевтических средств, ингибирующих ММП. Инокулируют одну изолированную колонию трансформанта каталитического домена pET His-tag pro MMP-3 из пластины, устойчивой к ампициллину хлорамфениколу LB, в пяти миллилитрах устойчивой среды LB ампициллина хлорамфеникола при 37 градусах Цельсия.
Сохраните аликвоты из каждой культуры и подготовьте 40% запасов глицерина. Привить однолитровую колбу, содержащую 500 миллилитров lb ампициллина хлорамфеникола, устойчивую к среде, до оптической плотности от 0,05 до 0,1 при 600 нанометрах с ночной культурой. Измерьте оптическую плотность на 600 нанометров в нескольких временных точках, обычно в течение трех-четырех часов, пока она не упадет между 0,4 и 0,6.
Индуцировать культуры с одним молярным запасом IPTG до конечной концентрации одного миллимоляра. Насиживайте в шейкере с температурой 37 градусов в течение дополнительных трех-четырех часов. Центрифугируйте клетки в конических бутылках по 250 миллилитров при 13 000 г и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, повторяя до тех пор, пока культуры не будут полностью гранулированы.
Добавьте три миллилитра лизисного буфера на грамм гранулы и повторно суспендируйте гранулу путем вихря или пипетирования. Добавьте 1,25 миллилитра массой 10% по объему дезоксихолата натрия на один литр культуры. Добавьте 10 микролитров ДНКазы I на один литр культуры.
Встряхните при комнатной температуре в течение 30 минут при 150 об/мин. Центрифуга в течение 10 минут при 13 000 G и четырех градусах Цельсия. Выбросьте супернатант.
Повторно суспендировать гранулу по 100 миллилитров на литр культуры включения тела буфера путем пипетки вверх и вниз. Храните образцы на льду во время обработки ультразвуком, чтобы предотвратить перегрев. Обрабатывайте каждый образец ультразвуком в течение шести циклов по 15 секунд, выход пять и 50% импульс.
Центрифугируйте образцы в течение 10 минут при 13 000 G и четырех градусах Цельсия. Проверьте гранулу. Если гранула компактная, откажитесь от супернатанта.
Повторно суспендируйте каждую гранулу из однолитровой культуры и пяти миллилитров солюбилизационного буфера. Инкубируйте в течение не менее 30 минут на льду, чтобы позволить белкам солюбилизироваться. Центрифугируйте клетки в течение 10 минут при 13 000 G в четыре градуса Цельсия.
Если гранула образуется после центрифугирования, перелейте супернатант в отдельную коническую трубку объемом 50 миллилитров. Повторно суспендируйте гранулу еще в пяти миллилитрах буфера солюбилизации на один литр культуры путем пипетирования вверх и вниз. Центрифуга в течение 10 минут при 13 000 G и четырех градусах Цельсия.
Далее потяните супернатанты. Выбросьте гранулу или храните ее при минус 80 градусах Цельсия для дополнительной обработки ультразвуком. Заготовьте против буфера промывки HT и запишите A280 первой фракции промывки.
Повторяйте с другими фракциями до тех пор, пока A280 не приблизится к исходному уровню. Немедленно элюируют помеченные His белки, добавляя пять миллилитров буфера элюирования HT. Соберите проточную фракцию от 0,5 до одного миллилитра в микрофьюжных пробирках с маркировкой HT elution.
Измерьте A280 фракции элюирования. Если A280 больше 0,3 миллиграмма на миллилитр, разбавьте фракцию буфером равновесия HT. Погрузите элюированные фракции MMP в диализную трубку в один литр диализного буфера и перемешайте трубку и ее содержимое на магнитном перемешивании в течение не менее восьми часов при четырех градусах Цельсия.
Переложите на один литр диализа буфер два и перемешайте трубку и ее содержимое на магнитном перемешивании в течение не менее восьми часов при четырех градусах Цельсия. Далее перекладывают на один литр диализного буфера три и перемешивают трубку и ее содержимое на магнитном перемешивании в течение не менее восьми часов при четырех градусах Цельсия. Перенесите образец в соответствующий контейнер и пометьте его как набранный MMP.
Осмотрите трубку на наличие осадка. На один миллилитр аликвоты одного миллиграмма на миллилитр MMP добавьте 50 микролитров 20 миллимолярных APMA, чтобы достичь конечной концентрации APMA в один миллимоляр. Если образуется осадок, центрифугируйте его с максимальной скоростью в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Храните супернатант в 1,5-миллилитровой микрофьюжной трубке с маркировкой активированный MMP. Выбросьте осадок в контейнер, маркированный для отходов APMA. SDS-PAGE был запущен для сравнения фракций элюирования очистки His-tag каталитического домена His-tag pro MMP-3 из клеток BL21 DE3 в ячейках R2DP.
Первые восемь элюционных фракций помеченного His каталитического домена MMP и клеток BL21 DE3 показали меньше белка, чем в каталитическом домене MMP с меткой His в клетках R2DP. Показаны индуцированные, реконвертированные, концентрированные, активированные и обессоленные фракции клеток MMP3 CD и R2DP. При активации молекулярная масса активированного диапазона MMP-3 CD составляет примерно 20 килодалтонов, в отличие от помеченного Гисом зимогена, который остается на уровне около 30 килодалтонов.
При центрифугировании клеточных лизатов гранулы могут быть не компактными. Когда это произойдет, больше увлажняйте ультразвуком и дольше центрифугируйте. При реконцентрации белка может произойти осаждение.
Растворите его в буфере солюбилизации и повторите процесс. Процедура, описанная здесь, предоставляет подробный метод растворимой экспрессии активных человеческих MMP, который в конечном итоге может быть использован для понимания молекулярного механизма ферментативной активности MMP. Альтернативные методы очистки белка, такие как FPLC, могут быть выполнены для очищенных белков MMP.
