Протокол иллюстрирует, как выполнять in vivo глубоководную трехфотонную микроскопию в мозге мыши и взрослых рыбок данио. Две важные модельные системы в науках о жизни. Длинноволновая трехфотонная микроскопия позволяет in vivo получать изображения неповрежденных тканей или органов на глубинах, недоступных для двухфотонной микроскопии.
Этот метод может помочь нам понять основные механизмы неврологических заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и аутизм, где отсутствует полное понимание того, как болезнь влияет на мозг. Демонстрацию процедуры визуализации мозга мышей будет Кибек Чо, постдокторант-исследователь из нашей лаборатории, а демонстрацией процедуры визуализации мозга рыбок данио будет Кристин Колкман, научный сотрудник из Исследовательской лаборатории Фетчо. Для начала включите лазер и установите центральную длину волны холостого хода неколлинеарного оптического параметрического усилителя на 1, 300 или 1 700 нанометров, затем поместите импульсные компрессоры на световой путь, чтобы предварительно чирикать фемтосекундный лазер и оптимизировать продолжительность импульса для трехфотонной визуализации.
Установите угол между кремниевой пластиной и траекторией лазера под углом Брюстера, чтобы максимизировать коэффициент пропускания лазера, а затем поверните кремниевую пластину, чтобы достичь угла Брюстера, минимизируя отражение. Затем поместите зеркала-флипперы, чтобы удобно переключаться между линиями луча 1 300 и 1 700 нанометров. Поместите полуволновую пластину, установленную на ступени вращения, и поляризационный разветвитель пучка для управления интенсивностью лазера, затем поместите блокиратор луча в траекторию отражения сплиттера луча.
Приготовьте чашку Петри с 0,5 сантиметрами 2% агара с высокой температурой плавления. Как только агар остынет и затвердеет, вырежьте прямоугольное отверстие в агаре длиннее и немного шире, чем рыба. Используя воск, прикрепите тонкую трубку к чашке Петри с одним концом в прямоугольнике и трубкой большего диаметра к краю чашки Петри.
Затем обезболивайте рыбу, помещая ее в 0,2 миллиграмма на миллилитр раствора трицина, затем поместите анестезированную рыбу на бок на влажную губку, затем, используя микрошприц, ретро-орбитально введите 3 микролитра бромида панкурония, чтобы парализовать рыбу и ненадолго поместите ее в раствор Хэнка, чтобы убедиться, что она полностью парализована. Затем поместите рыбу спинной стороной вверх в чашку Петри головкой к трубке, затем, используя щипцы, осторожно откройте рот рыбы и сдвиньте трубку в рот. Осторожно сдвиньте рыбу к трубке так, чтобы трубка была в задней части рта рыбы.
Быстро, но осторожно высушите агар вокруг рыбы и удалите воду сверху. Окуните небольшой кусочек лабораторной ткани в лабораторный клей и нанесите ткань на агар с обеих сторон рыбы и на спину рыбы хвост к жабрам. Затем обезболивайте кожу рыбы, помещая небольшую каплю бупивакаина непосредственно на поверхность головы, затем поднесите чашку Петри с рыбой к микроскопу.
Наполните блюдо водой для рыбы и подключите трубку к водяному насосу, чтобы закачать системную воду в рот рыбы. Убедитесь, что вода насыщается кислородом с помощью барботера и нагревается до 30 градусов по Цельсию с помощью аквариумного нагревателя. Для получения изображения поместите объектив с низким увеличением на трехфотонный микроскоп, затем поместите чашку Петри, содержащую рыбу и трубки, под микроскоп и используйте светодиодный источник света для освещения чашки Петри.
В программном обеспечении для получения изображения откройте режим камеры, нажмите «В реальном времени», выберите канал A в правой части экрана и настройте настройки гистограммы, чтобы четко видеть изображение. После установки настройки двигателя на контроллере двигателя на базу, опустите объектив до тех пор, пока рыба не будет видна. Поместите центр головы рыбы в центр поля зрения, затем переместите цель вверх и в сторону от головы рыбы.
Замените объектив с низким увеличением объективом с высокой числовой диафрагмой для трехфотонной визуализации, а затем переместите его близко к голове рыбы. Установите значения осей всех двигателей равными нулю. Медленно опустите объектив, следя за тем, чтобы объектив не контактировал с головой физически.
В программном обеспечении ПЗС-камеры прекратите перемещение объектива, когда видна верхняя часть головы, и установите местоположения X, Y и Z равными нулю. Выключите светодиодный источник света и закройте темную завесу вокруг системы, затем переведите программное обеспечение для сбора изображений в многофотонный режим GG для трехфотонной визуализации и установите мощность под объективом менее одного милливатта. Нажмите кнопку Live в программном обеспечении для получения изображений.
Откройте каналы PMT и при необходимости отрегулируйте коэффициент усиления PMT и уровень фона. Медленно перемещайтесь вверх по объективу, чтобы найти поверхность головы, контролируя канал THG от крупных кровеносных сосудов и поверхности оконного стекла. После перемещения объектива близко к окну нанесите воду между объективом и краниальным окном, затем установите значения осей всех двигателей равными нулю.
Нажмите кнопку Live в программном обеспечении для получения изображений. Откройте каналы PMT и отрегулируйте коэффициент усиления PMT и уровень фона по мере необходимости, затем медленно перемещайтесь вверх по объективу, чтобы найти поверхность скольжения крышки, контролируя канал THG от крупных кровеносных сосудов и поверхности оконного стекла. Отрегулируйте ориентацию окна, если это необходимо, затем обнулите двигатели, чтобы определить поверхность мозга.
Выполняйте визуализацию и регулируйте уровень мощности в соответствии с глубиной изображения. Высокое разрешение, неинвазивная и глубокая визуализация генетически меченых нейронов в мозге взрослых рыбок данио достигается с помощью трехфотонной микроскопии. Также может наблюдаться распределение клеточных слоев в зрительном тектуме и мозжечке.
Функция камеры микроскопа была использована для обнаружения рыбы. Череп виден в канале THG, который помогает ориентироваться в мозге и находить верхнюю поверхность. Нейроны различимы с высоким соотношением сигнал/фон глубоко в мозге взрослого человека.
Здесь показаны многоцветные трехфотонные изображения нейронов, меченных GCaMP6s, и кровеносных сосудов, меченных texas Red, вместе с сигналами THG в мозге взрослой мыши. При оптимизации установки были успешно получены высококонтрастные изображения на расстоянии до 1,2 миллиметра от поверхности мозга в области гиппокампа CA1. Следы активности кальция нейронов, меченных GCaMP6s, на глубине 750 микрометров для 10-минутного сеанса записи показали высокую точность записи.
Эта установка может помочь визуализировать активность нейронов, чтобы понять функцию мозга. Он также может быть использован для отслеживания движения клеток в биологической ткани для понимания различных биологических систем. Кроме того, скорость кровотока также может быть измерена для мониторинга здоровья животного.
