Наш протокол описывал использование флуоресцентных или люминесцентно-экспрессирующих рекомбинантных SARS-CoV-2 для обнаружения вирусов in vivo и ex vivo в живой визуализации и вирусного отслеживания в трансгенной мышиной модели SARS-CoV-2 K18 человека ACE2. Основным преимуществом этого метода является применение и осуществимость обнаружения и отслеживания вируса для исследований IN vivo и ex vivo SARS-CoV-2 в трансгенной мышиной модели K18 ACE2 человека. Использование визуализации IN VIVO SARS-CoV-2 в трансгенной мышиной модели K18 ACE2 человека представляет собой отличный вариант для оценки терапевтических средств для лечения инфекции SARS-CoV-2 in vivo.
Внедрение репортеров SARS-CoV-2 представляет собой отличный вариант для оценки патогенности, репликации вируса и трофики in vivo. Для исследований in vivo с люциферазой, экспрессирующей SARS-CoV-2, рекомендуется бритье мышей и быстрая визуализация после инъекции субстрата для улучшения сигнала биолюминесценции. Начните мониторинг биолюминесценции, запустив систему визуализации in vivo или IVIS, и настроив параметры, щелкните режим изображения в режиме Биолюминесценция, затем откройте фильтр и установите время экспозиции в Auto.
Затем удалите уже выбритую и обезболенную мышь из изоляционной камеры и используйте иглу 25 калибра для ретроорбитального введения 100 микролитров субстрата люциферазы, разбавленного от 1 до 10 в PBS, мыши. Затем поместите мышь обратно в изоляционную камеру, перенесите изоляционную камеру на машину IVIS, которая оснащена нагревательным компонентом для предотвращения переохлаждения, и закройте дверцу тепловизора IVIS для инициализации изображения, выбрав Acquire в программном обеспечении. Чтобы проанализировать полученные изображения биолюминесценции, используйте инструмент ROI или область интереса в программном обеспечении для обозначения точного сигнала и измерения потока.
Запустите программное обеспечение для создания образов и настройте параметры. Нажмите режим изображения на Флуоресценция, установите возбуждение на 500 нанометров и эмиссионные фильтры на 530 нанометров и установите время экспозиции на Auto. Проведите некроскопию и иссекните легкие у мышей.
Поместите иссеченные легкие в 6-луночную пластину, содержащую два миллилитра 1X PBS, и промойте, чтобы удалить избыток крови. Дезинфекция и очистка хирургических инструментов между образцами с использованием 70% этанола. После инициализации аппарата IVIS поместите легкие на черный лист и отделите ткани друг от друга.
Затем поместите лоток внутрь изоляционной камеры внутри шкафа биобезопасности, а затем перенесите изоляционную камеру в IVIS. Закройте дверцу тепловизора IVIS и нажмите «Получить», чтобы запустить систему обработки изображений. Чтобы проанализировать флуоресценцию, используйте инструмент ROI и нарисуйте ROI вокруг каждого из отдельных легких.
Измерьте каждую рентабельность инвестиций вручную, а затем используйте средние значения эффективности излучения и вычтите из зараженных мышей. Как только визуализация будет завершена, поместите ткани в криотрубу для замораживания сухого льда, чтобы хранить при минус 80 градусах Цельсия для последующей обработки. Используя супернат, полученный из тканевых гомогенатов, выполняют десятикратное последовательное разбавление и заражают сливающиеся монослои клеток Vero E6 одним миллилитром каждого внебиржевого разведения в трех.
Дайте вирусу адсорбироваться в течение одного часа при 37 градусах Цельсия в увлажненном 5% инкубаторе углекислого газа. После этого промыть клетки одним миллилитром 1X PBS, а затем инкубировать клетки в двух миллилитрах постинфекционной среды, содержащей 1% агара, в увлажненном инкубаторе 5% углекислого газа при 37 градусах Цельсия в течение 72 часов. После инкубации инактивируйте пластины в 10% нейтральном буферизованном формалине в течение 24 часов при четырех градусах Цельсия, гарантируя, что вся пластина погружена.
Выньте пластины из третьего уровня биобезопасности и трижды промывайте клетки одним миллилитом 0,5% Тритона Х-100 в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем блокируют пермеабилизированные клетки одним миллилитром 2,5 бычьего сывороточного альбумина или BSA и PBS в течение одного часа при 37 градусах Цельсия с последующей инкубацией в одном миллилитре одного микрограмма на миллилитр белка SARS-CoV кросс-реактивного моноклонального антитела 1C7C7, разбавленного в 2,5 BSA в течение одного часа при 37 градусах Цельсия. Промыть клетки три раза одним миллилитром 1X PBS и разработать бляшки с использованием наборов субстрата ABC и диаминобензола или DAB, пероксидазы в соответствии с инструкциями производителя, а затем рассчитать вирусные титры как единицы образования бляшек на миллилитр.
В исследовании было замечено, что биолюминесцентная нанолюцифераза, или Nluc, была легко обнаружена и мыши, инфицированные rSARS-CoV-2 Nluc, но не те, кто инфицирован rSARS-CoV-2 дикого типа или имитация заражения. Количественные анализы показали интенсивность Nluc в разные дни после заражения. Грубые поражения на поверхности легких мышей, инфицированных rSARS-CoV-2 Nluc, были сопоставимы с таковыми в группе инфицированных rSARS-CoV-2 дикого типа.
Кроме того, обнаруженные вирусные титры и инфицированные rSARS-CoV-2 Nluc мыши были сопоставимы с теми, кто был инфицирован rSARS-CoV-2 дикого типа во всех органах в разные дни после заражения. В то же время активность Nluc была обнаружена только в органах у мышей, инфицированных rSARS-CoV-2 Nluc. Отдельная группа инфицированных и инфицированных вирусом мышей контролировалась в течение 12 дней на предмет изменений массы тела и выживаемости.
Мыши, инфицированные rSARS-CoV-2 Nluc и rSARS-CoV-2 дикого типа, потеряли до 25% массы тела и все они поддаются вирусной инфекции в период от семи до восьми дней после заражения. После заражения rSARS-CoV-2 Венерой экспрессия Венеры была легко обнаружена во всех легких у мышей, инфицированных rSARS-CoV-2 Venus, но не у мышей, инфицированных rSARS-CoV-2 дикого типа или имитационных инфицированных. Количественные анализы показали, что интенсивность Венеры достигает пика через два дня после заражения и уменьшается в течение инфекции и легких инфицированных мышей.
Изображения поверхности легких показали грубые поражения мышей, инфицированных rSARS-CoV-2 Venus, были сопоставимы с поражениями инфицированных rSARS-CoV-2 диких мышей. Кроме того, заражение rSARS-CoV-2 Venus привело к сопоставимым вирусным титрам с теми, которые наблюдались у мышей, инфицированных rSARS-CoV-2 дикого типа во всех органах. Мыши, инфицированные rSARS-CoV-2 Venus и rSARS-CoV-2 дикого типа, потеряли до 25% массы тела и умерли от вирусной инфекции к девятому дню после заражения без выживания.
Результаты репортерской экспрессии SARS-CoV-2 показали, что они являются действительными суррогатами вирусной инфекции. Таким образом, это может привести к быстрому выявлению и оценке контрмер для лечения инфекции SARS-CoV-2.
