При ретинопатиях сосудистые изменения являются первым признаком, который обнаруживается клиницистами. Они следят за прогрессированием заболевания и выбирают лечение в соответствии с этими изменениями. Несколько животных моделей были разработаны для изучения различных стадий патологии.
В этой работе мы покажем, как измерять различные сосудистые изменения. Для этого мы собираемся использовать две модели животных. Одним из них является модель мыши, индуцированная кислородом ретинопатия, которая воспроизводит ретинопатию недоношенных и некоторые аспекты пролиферативной диабетической ретинопатии.
Здесь мы собираемся измерить аваскулярные области, неоваскулярные области, а также дилатацию и извилистость артериол. В нашей лаборатории была разработана модель метаболического синдрома мыши, которая индуцирует непролиферативную ретинопатию. В этой работе оценивали плотность сосудов и ветвление.
После жертвоприношения мышей энуклеатизируйте ножницами. Зафиксируйте энуклеированные глаза свежеприготовленным параформальдегидом в течение одного часа при комнатной температуре. Под рассекающим микроскопом удаляют роговицы ножницами, разрезая вдоль лимбуса и рассекая всю сетчатку.
Отбросьте передний сегмент глаза, а затем отделите сетчатку от RPE-сосудистой оболочки. Поместите сетчатку в 200 микролитровые трубки. Затем блокируют и пермеабилизируют сетчатку в 100 микролитрах TBS, содержащей 5%-ный бычий сывороточный альбумин Тритон в течение шести часов при четырех градусах с мягким перемешиванием в шейкере.
Затем переверните трубку, чтобы поместить сетчатку в чашку и удалите блокирующий раствор пипеткой. Добавьте 100 микролитр раствора, содержащего изолектин. Оберните трубки алюминиевой фольгой для защиты образцов от света.
Инкубировать сетчатку раствором лектина на ночь при четырех градусах с мягким перемешиванием в шейкере. Промыть сетчатку 100 микролитрами TBS-Triton в течение 20 минут с мягким перемешиванием в шейкере. Повторите этот шаг три раза.
Поместите сетчатку в слайд и добавьте каплю PBS. Под рассекающим микроскопом выполните четыре одинаково удаленных разреза от краев сетчатки в сторону зрительного нерва. Чтобы развернуть лепестки сетчатки, используйте щипцы или небольшие кусочки фильтровальной бумаги.
Убедитесь, что сторона фоторецептора обращена вниз. Удалите оставшуюся PBS со слайда с помощью фильтровальной бумаги. Затем добавьте медиану крепления и крышку.
Дайте высохнуть в течение одного часа при комнатной температуре. Храните слайды под четырьмя градусами, защищенными от света. В конфокальном микроскопе поместите слайд в пластину лицевой стороной вниз.
Сфокусируйте верхнее сплетение сосудистой системы сетчатки и выберите область для начала получения изображения. Задайте общие параметры лазера в программном обеспечении. Задайте координаты по осям X, Y и Z.
Инициализируйте сканирование. После завершения процесса сканирования откройте изображение и сохраните его с предпочтительным расширением. В программном обеспечении ImageJ FIJI перейдите в строку меню и нажмите файл, открыть.
Выберите изображение для обработки. В окне Параметр импорта биоформатов выберите Отображать метаданные OME-XML и нажмите кнопку OK.In окне Метаданные OME выполните поиск информации о размере пикселя. Скопируйте эти данные.
Для калибровки изображения перейдите в строку меню и выберите Свойства изображения. Скопируйте информацию и нажмите кнопку ОК. Присвойте изображению предпочтительный lut. Чтобы визуализировать весь стек в одном изображении, перейдите в строку меню и выберите Изображение, Стеки, Z Project.
В появившемся окне проекции выберите все стеки, где визуализируются сосуды. В поле Тип проекции выберите Средняя интенсивность и нажмите кнопку ОК. Перейдите в строку меню, Изображение, Настройка, Яркость/Контрастность. Нажмите кнопку Применить и сохраните изменения.
Скопируйте параметры, выбранные для яркости и контрастности. Они должны быть одинаковыми для всех изображений. В строке меню выберите инструмент «Палочка».
Выделяют область сетчатки, в которой отсутствуют сформированные сосуды. Нажмите клавишу T на клавиатуре, чтобы записать выбранные области в диспетчере ROI. Щелкните Измерить в диспетчере ROI, чтобы получить информацию об аваскулярной области.
Повторите эти шаги, чтобы измерить общую площадь сетчатки. В строке меню выберите инструмент «Палочка». Увеличьте масштаб изображения, чтобы лучше визуализировать неососуды.
Выделите неососуды один за другим с помощью инструмента «Палочка». Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI. Щелкните Измерить в диспетчере ROI, чтобы получить данные области.
В строке меню выберите инструмент «Прямая линия». Увеличьте изображение, чтобы лучше визуализировать стену сосуда. Выполните три поперечные линии к основному судну перед первой веткой.
Нажмите клавишу T на клавиатуре, чтобы записать выбранные области в диспетчере ROI. Щелкните Измерить в диспетчере ROI, чтобы получить данные о расстоянии. В строке меню щелкните правой кнопкой мыши значок инструмента «Прямая линия» и выберите «Сегментированная линия».
Проведите линию внутри сосуда от зрительного нерва до первого разветвления сосуда, следуя сосудистой форме. Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI. В строке меню выберите инструмент «Прямая линия».
Проведите линию от зрительного нерва до первого разветвления сосуда. Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI. Щелкните Измерить на диспетчере ROI, чтобы получить данные о расстояниях.
С помощью инструмента «Овал» строки меню определите область, применяемую одинаково ко всем экспериментальным условиям. Выбранная область должна представлять собой концентрический круг, нарисованный вокруг зрительного нерва. Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI.
Вручную подсчитайте количество первичных ветвей, возникающих из основных сосудов внутри зоны выбора. Преобразуйте изображение в 8-битный режим. Перейдите в плагины в строке меню, выберите Анализ сосудов, Плотность сосудов.
Определите область с помощью инструмента «Квадрат» строки меню, в которой требуется измерить плотность сосудов. Нажмите кнопку ОК. Программа отобразит новое окно с необходимой информацией. В первом экспериментальном примере была использована модель мыши с кислородно-индуцированной ретинопатией.
Интравитреальные инъекции проводили на 12-й послеродовой день для определения эффективности препарата как антиангиогенного. Мыши, которым вводили транспортное средство, использовались в качестве контроля. Аваскулярные области определяются как зоны, в которых отсутствуют кровеносные сосуды сетчатки.
Из полученных изображений аваскулярные области могут быть количественно определены как сумма областей без сосудов, разделенных общей площадью сетчатки. Участки с механическими повреждениями также показывают отсутствие сосудов. Чтобы выявить поврежденные участки, проанализируйте целостность нейронных слоев с помощью пятна Hoechst.
Неовсосуды представляют собой сосуды малого калибра, которые происходят из ранее существовавших сосудов верхнего сосудистого сплетения. Мы рассчитали площадь, занимаемую пучками неосколков, путем количественной оценки неоваскулярной области сетчатки, занятой общей площадью сетчатки. Поскольку форма и размер неосуходов варьируются, иногда они могут выглядеть похожими на обломки и артефакты.
Чтобы отличить неосмешники, убедитесь, что хохолок растет из зрелого сосуда. Для анализа дилатации мы измерили диаметр основного сосуда на трех высотах перед первой ветвью. Исследователи должны определить заранее определенное расстояние для измерения диаметра сосуда, чтобы уменьшить изменчивость результатов.
В идеале самая дальняя точка от зрительного нерва должна составлять около 300 микрометров. Мы предлагаем провести анализ, а позже, в среднем не менее шести животных на состояние. Что касается извилистости, мы измеряем расстояние, пройденное главным сосудом по его форме, относительно прямолинейного расстояния между зрительным нервом и первой точкой ветвления.
Как мы видим на изображении, существует неоднородность в извилистости основных сосудов. Для получения репрезентативного результата необходимо количественно оценить не менее шести мышей на каждое состояние. Последние параметры, ветвление и плотность сосудов, были проанализированы в модели метаболического синдрома, демонстрирующей непролиферативную ретинопатию.
Для измерения ветвления сосудов мы определили площадь количественного определения, нарисовав концентрический круг, а затем подсчитали, одну за другой, первичные ветви, возникающие из главного центрального сосуда. Из полученных изображений плотность сосудов была количественно определена как площадь, занимаемая сосудами, разделенная на площадь ROI, которая была расположена в разных местах на каждой микрофотографии. Избегайте количественной оценки областей с механическими повреждениями.
Если есть более двух областей с проколами, сетчатку необходимо отбросить. Таким образом, в этой статье мы показали классические, хорошо зарекомендовавшие себя и воспроизводимые методы количественной оценки некоторых наиболее релевантных параметров с учетом в клинической практике.
