Анализ на основе микроскопии для изучения и анализа эндосом рециркуляции с использованием незаконного оборота SNARE. Это меланоциты кожи. Органеллы черного цвета, которые вы видите внутри клеток, называются меланосомами.
Меланосомы известны как класс органелл, называемых лизозомными органеллами или LRO. Рециркулирующие эндосомы представляют собой трубчатые везикулярные органеллы из ранних или сортирующие эндосомы во всех типах клеток. Эти органеллы играют ключевую роль в биогенезе меланосом, органелл, связанных с лизозомом, продуцируемых меланоцитами.
Рециркулирующие эндосомы доставляют специфический для меланоцитов груз к преждевременным меланосомам во время их формирования. генерация рециркулирующих эндосом, наблюдаемых при нескольких синдромах, представляет собой клетки при гиперпигментации кожи, волос и глаз. Поэтому изучение динамики рециркуляции эндосом полезно для понимания функции этих органелл в нормальных и болезненных условиях.
Это исследование направлено на измерение динамики эндосом рециркуляции с использованием арестовывающего синтаксиса SNARE-13. Первым этапом является посев меланоцитов мышей на предварительно обработанные покровы. Покройте стеклянные крышки в чашке Петри в матричной среде базальной мембраны.
И высушите его в тканевом культуральном капюшоне в течение 15 минут. Вымойте крышки один раз с 1X PBS перед использованием. Засейте клетки на основную мембрану, покрытую оболочкой со средним покрытием, с 50-60% компетентностью.
Всегда добавляйте 200 наномоляров PMA к суспензии покрытой ячейки в полной среде RPMI. После посева клеток инкубируйте чашку, содержащую клетки, в CO2-инкубаторе в течение 12-24 часов. Вторым этапом является трансфекция клеток с помощью плазмид синтаксина-13.
Инкубируют наконечники, содержащие ДНК и трансфекционный реагент, перемешивают в течение пяти минут и перемешивают без повторного пипетирования. Постукивайте по тюбику рукой каждые десять минут в течение 30 минут при комнатной температуре. Во время инкубации промывайте клетки дважды с 1X PBS, один раз с OPTI-MEM, а затем добавляйте 1 мил OPTI-MEM к клеткам.
После 30 минут инкубации добавьте смесь ДНК трансфекционного реагента в клетки по каплям, накрыв блюдо. Инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в течение шести часов. Аспирировать среду OPTI-MEM трансфекционным реагентом и добавить полную RPMI-среду, дополненную 200 наномолярами PMA.
Инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в течение 48 часов. Третий шаг – фиксация клеток. Обратите внимание, что следующая процедура выполняется вне вытяжки культуры тканей.
После 48 часов трансфекции дважды промыть клетки 1X PBS, а затем зафиксировать клетки 3% формальдегидом в течение 30 минут. После фиксации дважды промыть ячейки 1X PBS и сохранить крышки в 1X PBS до дальнейшего использования. Альтернативно, ячейки могут быть установлены на стеклянных пластинах или храниться при четырех градусах Цельсия.
Четвертым этапом является иммуноокрашивание клеток. Подготовьте влажную камеру. Поместите вырезанный кусок парапленки на фильтровальную бумагу мыши в чашку Петри.
Покрытие алюминиевой фольгой. Приготовьте 25 микролитров раствора первичного антитела. Добавляют антитела в разведении от одного до 200.
Добавьте этот раствор в виде капли на парапленку во влажную камеру. Осторожно поднимите крышку щипцами. Инвертируйте его на капле первичного раствора для окрашивания антител, а затем накройте крышку влажной камеры.
Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Аналогично, готовят раствор вторичного антитела в разведении от одного до 500 и помещают его на парапленку рядом с крышкой во влажной камере. Для окрашивания ядра добавляют DAPI в разведении от 120 000 до 130 000 в раствор.
Используя щипцы, осторожно подберите крышку из раствора первичного антитела и дважды окуните его в 1X PBS. Коснитесь крышки на папиросной бумаге, чтобы удалить лишний PBS на обложке. Поместите его на раствор для окрашивания вторичных антител во влажной камере и не подвергайте его воздействию света, благодаря наличию флуоресцентно окрашенных антител в растворе.
После инкубации осторожно подберите крышку из раствора вторичного антитела, а затем дважды окуните ее в 1X PBS. Кроме того, нажмите на крышку на папиросной бумаге, чтобы удалить избыток PBS на крышке. Поместите 12 микролитров реагента для визуализации на стеклянную горку и аккуратно поместите витражную крышку на монтажный реагент.
Переверните стеклянный слайд на папиросной бумаге, а затем аккуратно надавите. Затем изобразите крышку с помощью флуоресцентного микроскопа и проанализируйте изображения с помощью ImageJ. Шестым этапом является количественная оценка перекрытия между рециркулирующими эндосомами локализованных белков и меланосом.
Количественная оценка колокализации синтаксина-13 дельта-129 с меланосомами. Иммунофлуоресцентная микроскопия синтаксина-13 в меланоцитах мышиного дикого типа показала, что GFP-синтаксин-13 дикого типа локализован в виде везикулярных и трубчатых структур. А GFP-syntaxin-13 delta-129 локализует кольцеобразные структуры в дополнение к поверхности ячейки.
Кроме того, внутриклеточный кольцеобразный GFP-syntaxin-13 delta-129 показал колокализацию с белком меланосомы TYRP1 в ярких меланосомах с полевым изображением. Как показано ранее, в меланосомах наблюдается когорта сверхэкспрессированного GFP-syntaxin-13 дикого типа. Для измерения относительной локализации GFP-syntaxin-13 wild type и GFP-syntaxin-13 delta-129 к меланосомам было использовано программное обеспечение Fiji и проведен анализ с помощью плагина JACOP.
Измеренный коэффициент перекрытия Мандера, то есть MOC, между GFP-syntaxin-13 delta-129 и TYRP1 примерно в 1,5 раза выше по сравнению с GFP-syntaxin-13 wild type с TYRP1. Интересно, что TYRP1 показал в 2,9 раза более высокие значения MOC с GFP-syntaxin-13 delta-129 по сравнению с GFP-syntaxin-13 wild type. Эти данные свидетельствуют о том, что локализация меланосом GFP-syntaxin-13 дельта-129 относительно выше по сравнению с диким типом GFP-syntaxin-13 в устойчивом состоянии.
Количественная оценка синтаксина-13 дикого типа локализации эндосом рециркуляции. Иммунофлуоресцентная микроскопия GFP-syntaxin-13 дикого типа показала колокализацию с известным рециркулирующим эндосомальным белком Rab11. MOC между диким типом GFP-syntaxin-13 с mCherry-Rab11 примерно в 1,4 раза выше по сравнению с mCherry-Rab11 с диким типом GFP-syntaxin-13.
Для измерения количества и длины эндосомных канальцев GFP-syntaxin-13 дикого типа использовалось программное обеспечение Фиджи, описанное в разделе протокола. mCherry-Rab11 используется в качестве положительного контроля в экспериментах. Меланоциты, трансфектированные GFP-syntaxin-13 дикого типа, показали более высокое количество канальцев на клетку по сравнению с клетками, экспрессирующими mCherry-Rab11.
Однако канальцы уменьшаются при коэкспрессии как GFP-syntaxin-13 дикого типа, так и mCherry-Rab11 в клетках. Седьмым этапом является количественная оценка трубчатого числа и длины эндосом рециркуляции. Канальцы восстанавливаются при коэкспрессии как GFP-syntaxin-13 дикого типа, так и mCherry-Rab11 в клетках.
Интересно, что средняя длина канальцев как от GFP-syntaxin-13 wild type, так и от mCherry-Rab11 сопоставима друг с другом в клетках, экспрессирующихся по отдельности или вместе. Вместе эти данные свидетельствуют о том, что дикий тип GFP-syntaxin-13 локализуется для рециркуляции эндосом аналогично Rab11. Это исследование показало, что N-концевая доставка мутанта синтасин-13, то есть GFP-syntaxin-13 delta-129, локализуется на меланосомы GFP-syntaxin-13 delta-129, возможно, может быть использована в качестве репортера для везикулярного трафика от рециркуляции эндосом к поверхности клетки и LRO.
Напротив, дикий тип GFP-syntaxin-13 локализуется для рециркуляции эндосом аналогично Rab11. Это исследование показало, что дикий тип GFP-syntaxin-13 также может быть использован для маркировки эндосом рециркуляции в меланоцитах. Дикий тип GFP-syntaxin-13 может быть лучшим эндосомным маркером рециркуляции, чем Rab11, поскольку Rab11 изменяет эндосомальную динамику.
Все вместе GFP-syntaxin-13 дикого типа действует как потенциальный эндосомный маркер рециркуляции для изучения динамики в стационарных условиях.
