Здесь мы описываем учебный метод, основанный на быстрой тепловой инактивации протеазы для сохранения естественных внутриклеточных пептидов, предотвращения деградации в клетках и тканях с последующим относительным количественной оценкой пептидов с использованием изотопной маркировки. Этот метод маркировки имеет так много преимуществ. Реагенты коммерчески доступны, недороги, химически стабильны и позволяют анализировать до пяти образцов в одной сыворотке.
Начните с культивирования клеток нейробластомы человека в 15-сантиметровой чашке в DMEM, содержащей 15% FBS и 1% пенициллина стрептомицина. Поддерживайте клетки на уровне 37 градусов по Цельсию под 5% углекислого газа. Дважды промыть клетки PBS, затем добавить 10 миллилитров PBS, соскоблить клетки и собрать их в 15-миллилитровую трубку.
Центрифугируйте клетки в 800 раз G в течение пяти минут и удалите супернатант. Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре ультраочищенной деионизированной воды при 80 градусах Цельсия, затем перенесите содержимое трубки в двухмиллилитровую микрофьюжную трубку. После тепловой инактивации рыбок данио соберите весь мозг в двухмиллилитровую микрофьюжную трубку и заморозьте его при минус 80 градусах Цельсия до анализа.
Повторно суспендируйте образец ткани в одном миллилитре ультраочищенной деионизированной воды при 80 градусах Цельсия и обработайте ультразвуком с помощью зонда, используя 30 импульсов в одну секунду. Инкубируйте клеточный лизат или гомогенатную ткань при температуре 80 градусов Цельсия в течение 20 минут, затем охладите ее на льду в течение 10-30 минут. Добавьте 10 микролитров одного раствора молярной соляной кислоты на каждый миллилитр объема образца.
Перемешайте путем вихря в течение 20 секунд и высиживайте на льду в течение 15 минут. Центрифугируйте клеточный лизат или гомогенатную ткань в 12 000 раз G в четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. Соберите супернатант в низкосвязывающие белковые микроцентрифужные трубки и храните его при минус 80 градусах Цельсия.
Очистите ультрафильтрационные устройства водой и центрифугой при 2 300 G в течение трех минут, затем выбросьте воду из ультрафильтрационного устройства. Пипетка супернатанта в предварительно промытый отсечный фильтр на 10 килодалтонов и вращение в охлажденной центрифуге при четырех градусах Цельсия. Проверьте pH образца.
Уравновешивают колонку одним миллилитром 100%-ацетонитрила, затем промыть ее одним миллилитром 5%-ацетонитрила с 0,1% трифторуксусной кислотой. Загрузите весь объем образца в колонну и промыть колонну одним миллилитом 5%ацетонитрила с 0,1% трифторуксусной кислотой. Элюировать пептиды из колонки с 1,8 миллилитрами 1%ацетонитрила с 0,15% трифторуксусной кислоты в белковые низкосвязывающие микроцентрифужные трубки.
Полностью высушите образец в вакуумной центрифуге при температуре 30 градусов Цельсия и контролируйте время концентрации на дисплее. Храните образец при минус 80 градусах Цельсия. Повторное суспендирование пептидных образцов в 100-200 микролитрах ультраочищенной воды и пипетки 2,5 микролитра стандартных концентраций пептидов и образцов на белую 96-луночную пластину.
Добавьте 25 микролитров 0,2 молярного фосфатного буфера и 12,5 микролитра флуорескамина. Мягко гомогенизируйте в течение одной минуты на орбитальном ротаторе. Затем добавьте 110 микролитров воды, чтобы остановить реакцию.
Отрегулируйте настройки на спектрофлуфторметре, затем считайте пластину. Добавьте 1/10-й объем одного молярного триметиламмония бромида к каждому образцу пептида с содержанием пептида до 25 микрограммов. Убедитесь, что рН составляет от пяти до восьми, при необходимости регулируя с помощью соляной кислоты или гидроксида натрия.
Добавьте четыре микролитра недетерированного, дейтерированного формальдегида или дейтерированного формальдегида углерода-13. Перемешивайте в течение пяти секунд путем вихря. Добавьте четыре микролитра цианоборогидрида натрия или дейтерированного цианоборогидрида натрия в образец пептида.
Затем перемешайте образец в течение пяти секунд путем вихря. Инкубируйте образец пептида в вытяжке в течение двух часов при комнатной температуре, вихря каждые 30 минут. Повторяют добавление недейтерированного, дейтерированного или дейтерированного формальдегида углерода-13 и цианоборогидрида натрия или дейтерированного цианоборогидрида натрия, вихревого после каждого добавления.
Инкубируйте образцы в вытяжном шкафу на ночь при комнатной температуре. Добавьте 16 микролитров бикарбоната аммония и перемешайте путем вихря. Поместите образец на лед.
Добавьте восемь микролитров 5% муравьиной кислоты и вихрь еще на пять секунд. Объедините образцы пептидов, отрегулируйте рН между двумя и четырьмя, затем обессоливайте объединенные образцы на колоннах очистки обратной фазы с использованием ацетонитрила и трифторуксусной кислоты, как описано ранее. Полностью высушите образец в вакуумной центрифуге при 30 градусах Цельсия, затем храните его при минус 20 градусах Цельсия.
Меченые пептиды наблюдаются с помощью масс-спектров. Красные стрелки указывают на наличие пиковых пар различных пептидов, меченных двумя изотопными формами, L1 и L5, для сравнения между двумя различными образцами S1 и S2 соответственно. Масс-спектр пептида, присутствующего в трех различных образцах, S1, S2 и S3, помеченных метками L1, L3 и L5 соответственно, показан здесь.
Выполнена квадруплексная маркировка. Контрольные образцы S1 и S3 маркировали L1 и L3 соответственно и сравнивали с двумя экспериментальными образцами, S2 и S4 с маркировкой L2 и L4.No наблюдалась существенная разница. Изотопная маркировка использовалась для показа субстратов в продуктах in vitro для данной протеазы или пептидазы.
Здесь показан пептид, который не изменяется в присутствии фермента нейролизина. Пептиды, которые исчезают или уменьшаются в присутствии фермента, являются субстратами, в то время как те, которые увеличиваются, считаются продуктами. Рисунок является примером идентификации пептидной последовательности, выполняемой поисковой системой базы данных, помеченной тремя различными формами тегов.
Прежде чем он будет определен, убедитесь, что образец полностью прохладный, чтобы избежать разрыва пептидных связей, вызванных твердым подкислением. Кроме того, необходима очистка ультрафильтрационных устройств. масс-спектрометрия является отличным методом количественной оценки пептидов между различными экспериментальными условиями и для аналитических исследований путем выявления пептидазных субстратов.
