Этот протокол позволяет наблюдать и обнаруживать события транскрипции и дает представление о влиянии двухцепочечных разрывов ДНК на текущую транскрипцию гена. Основным преимуществом методики является наблюдение индивидуально меченых транскриптов РНК в одиночных клетках с интервалами времени в секунды в течение общего периода в один час и более. Этот метод дает представление о реакции на повреждение ДНК для исследования перекрестных помех между транскрипцией и клеточными процессами, такими как репликация ДНК и повреждения ДНК.
Наш совет заключается в наблюдении за клетками с использованием доксициклина и выполнении калибровочных измерений для обучения обнаружению сайта транскрипции и меченых молекул РНК. В 1,5-миллилитровой микроцентрифужной трубке готовят раствор А, содержащий 150 микролитров восстановленной сывороточной МЭМ плазменной ДНК и 2,5 мкг на микролитр ДНК в трансфекционном вспомогательном реагенте. Параллельно готовят раствор В, содержащий 150 микролитров восстановленного MEM сыворотки и 1,5 мкг на микролитр ДНК в трансфекционном реагенте на основе липидов.
Инкубировать оба раствора при комнатной температуре в течение пяти минут, затем аккуратно добавить раствор А к раствору В и инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре. Чтобы трансфектировать клетки, добавьте 300 микролитров смешанного раствора А и В по каплям в каждое блюдо и аккуратно распределите его. Храните стеклянную нижнюю чашку внутри 100-миллиметровой стандартной чашки для культивирования клеток и инкубируйте ее при 37 градусах Цельсия во увлажненной атмосфере с 5% углекислым газом.
Приготовьте 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку с 200 микролитрами DMEM с HEPES без фенолового красного цвета и добавьте 10% очищенную древесным углем фетальную бычью сыворотку, затем добавьте ТА. Примерно за час до начала микроскопического наблюдения индуцируйте транскрипцию генов-репортеров, добавляя доксициклин в питательную среду и осторожно смешивая, пипетируя вверх и вниз микропипеткой 200 микролитров. Транспортируйте клетки к микроскопу не менее чем за 30 минут до начала наблюдения и поместите 100-миллиметровую тарелку с клетками внутрь предварительно нагретой инкубационной камеры большого микроскопа. Поместите трубку микроцентрифуги с предварительно разбавленной ТА внутрь камеры окружающей среды большого микроскопа, чтобы нагреть ее до 37 градусов цельсия.
Замените крышку стеклянной нижней тарелки крышкой, которая имеет просверленное отверстие диаметром три миллиметра. Выберите цель погружения масла 100X на панели управления микроскопом и нанесите каплю погружного масла на объект. Установите стеклянную нижнюю чашку с ячейками внутри инкубационной камеры микроскопа и зафиксируйте ее на месте, затем закройте крышку сценического инкубатора и все дверцы корпуса микроскопа.
Запустите программное обеспечение для управления и управления микроскопом, откройте окно управления фокусом и щелкните панель области. В области выбора излучения щелкните поле 100% глаз, чтобы задать траекторию глазного пучка для прямого наблюдения образца глазами. В меню набора фильтров переключитесь на набор фильтров глаз и нажмите Brightfield, затем нажмите кнопку открыть Brightfield.
Переместите объектив микроскопа к стеклянной нижней чашке, пока масло не коснется стекла. Посмотрите через окуляры и вручную сфокусируйтесь на плоскости клеток, затем выключите открытую кнопку Brightfield. Оставьте клетки на 30 минут до начала экспериментальных наблюдений, чтобы они могли адаптироваться к условиям окружающей среды и предотвратить фокальный дрейф во время визуализации из-за градиентов температуры.
Установите 200-микролитровую микропипетку и 200-микролитровые фильтрующие наконечники при комнатной температуре. В окне управления фокусировкой программного обеспечения для управления микроскопом установите интенсивность лазера на 5% и введите значение 50 миллисекунд для времени экспозиции. Откройте окно захвата, чтобы настроить параметры для выполнения автоматического получения изображения трехмерных таймлапсов.
Выберите тип захвата 3D и установите от 12 до 16 оптических срезов, разделенных 0,4 микрометра. Установите флажки диапазона вокруг текущего и вернитесь в текущее положение после захвата. В области захвата таймлапса введите значение 120 для количества точек времени и 30 секунд для интервала.
Выберите набор конфокальных фильтров в соответствии с трансектированными флуоресцентными белковыми метками, как указано в текстовой рукописи, и установите время экспозиции для каждого канала на 50 миллисекунд. Используйте заданный ток для мощности лазера, чтобы использовать значение 5%, выбранное в окне фокусировки. В окне управления фокусом перейдите на панель камеры, выберите элемент управления отображением масштабного изображения и нажмите кнопку вручную, чтобы настроить фиксированный диапазон интенсивности изображения для отображения.
Выберите клетки для 3D-таймлапс-визуализации участков транскрипции при индукции двухцепочечного разрыва ДНК. Откройте ячейки и выберите три поля зрения в соответствии с условиями, описанными в обсуждении текста. Сфокусируйте каждую выделенную ячейку, ранее расположенную в центре поля зрения, с сайтом транскрипции в средней плоскости Z-стека.
Пометьте каждую позицию XYZ в плоскости XY окна управления фокусом, щелкнув заданное значение. Добавьте 200 микролитров предварительно разбавленного ТА в ячейки и начните 3D-визуализацию временных рядов, нажав кнопку «Пуск» в окне захвата. Сохраните данные изображения в формате данных программного обеспечения управления микроскопом на жестком диске компьютера управления микроскопом.
Добавьте 0,5 микрограмма на миллилитр доксициклина в питательную среду клеток за час до начала получения изображения микроскопии. Установите стеклянную нижнюю чашку внутри инкубационной камеры микроскопа и подготовьте получение изображения, как было продемонстрировано ранее. Используйте те же настройки интенсивности и экспозиции лазера, что и раньше.
Установите параметры захвата для 2D-временных рядов и установите 120 временных точек с интервалом 500 миллисекунд на панели захвата timelapse. Получите десятки калибровочных временных рядов из нескольких позиций, чтобы генерировать наборы данных для подсчета нескольких сотен измерений TFI с одним транскриптом. Используя этот протокол, получается график, отображающий количество флуоресцентно меченых репортерных транскриптов генов с течением времени с временным разрешением секунд в течение периодов до часов.
Здесь показан временной ход значений TFI сайта транскрипции гена-репортера PROM, помеченного накоплением белка оболочки MS2, помеченного зелеными флуоресцентными белковыми молекулами на зарождающихся транскриптах. Индукция одного DSB в генах-репортерах позволяет изучить его влияние на текущую репортерную транскрипцию генов и мониторинг событий транскрипции, возникающих из сайта DSB, а именно транскрипции, вызванной разрывом. Добавление ТА и индукция DSB приводит к подавлению транскрипции репортерного гена PROM примерно через 11 минут, которая не восстанавливается до 60 минут.
Полное восстановление сигнала PP7-RFP показывает инициацию транскрипции, вызванную разрывом. Ген антисмыслового репортера EXON 2 показывает прекращение транскрипций, управляемых промотором, которое затем заменяется антисмысловой транскрипцией, вызванной разрывом, что выявляется накоплением белка оболочки MS2, помеченного красным флуоресцентным белком, связывающимся с РНК, генерируемым из антисмысловых последовательностей стволовой петли MS2. Выбирая клетки для визуализации, настраивайте обработанную таймлапс-визуализацию, регулируя положение Z меченого сайта транскрипции на каждой позиции XY в центр стека Z, который необходимо получить.
И, наконец, добавление ТА, разбавленного в питательной среде, должно быть выполнено с особой осторожностью, чтобы предотвратить любые сдвиги заранее выбранных положений с клетками, подлежащими изображению. Визуализация одиночных транскриптов РНК в 3D с течением времени в живых клетках может быть применена для изучения транскрипции РНК во время репликации ДНК или изменений транскрипции во время прогрессирования клеточного цикла.
