Этот протокол обеспечивает высокую пропускную способность и надежный состав для анализа NHEJ, который может определить распространенность и относительное количество мутаций Indel в генетически отредактированных популяциях комаров. По сравнению со следующим поколением, или секвенированием Сэнгера, ddPCR имеет более быстрое время обработки результатов, что позволяет быстро и полностью анализировать генетические вариации для генетически модифицированных организмов. Этот метод должен быть в целом применим ко всем экспериментальным системам.
Продемонстрировать процедуру будет Тай Фам, штатный научный сотрудник из лаборатории Янга. Для начала подготовьте 25 микролитров цифровой капельной ПЦР или смеси образцов ddPCR путем добавления супермеса ddPCR, прямых и обратных праймеров, зондов HEX или FAM, ДНК и воды в пропорциях, описанных в тексте. Затем тщательно перемешайте реакцию путем вихря.
Используя 50-микролитровую многоканальную пипетку, загрузите 20 микролитров смеси образцов ddPCR в средний ряд картриджа. Затем используйте 200-микролитровую многоканальную пипетку, чтобы загрузить 70 микролитров масла в нижний ряд без образования пузырьков на протяжении всей пипетки. Поместите прокладку, касаясь только краев, избегая центра, вогнутой области, а затем надежно поместите пластину в генератор капель и закройте крышку, чтобы начать пробег.
Для переноса погружной смеси из верхнего ряда картриджа в 96-луночную пластину используйте многоканальную пипетку и опустите 40 микролитров жидкого образца на три-пять секунд под углом от 30 до 45 градусов. Затем медленно выталкивайте смесь в лунку в течение более трех секунд под углом 45 градусов, позволяя ей опуститься сбоку, а затем переходите ко второй остановке пипетки, чтобы полностью вытеснить жидкость. Используя фольгированные термоуплотнители, запечатайте пластины на пять секунд при температуре 180 градусов цельсия.
Поместите герметичную пластину в термоциклер и установите условия ПЦР для руководящих принципов сброса NHEJ, установив начальную денатурацию на уровне 95 градусов цельсия в течение 10 минут. Затем установите 40 циклов по 94 градуса цельсия в течение 30 секунд для денатуры, 55 градусов по Цельсию от одной минуты до отжига и 60 градусов по Цельсию в течение двух минут, чтобы продлить. После 40 циклов установите удержание на 98 градусов по Цельсию в течение 10 минут, а окончательное удержание на четыре градуса цельсия.
Используйте скорость рампы в два градуса Цельсия в секунду для всех этапов. Температура отжига будет варьироваться в зависимости от используемых зондов или грунтовки. Надежно поместите пластину в капельный считыватель с хорошей маркировкой A1 в левом верхнем углу.
Откройте программу и настройте пластину, обозначив FAM как известный опорный канал, а HEX как неизвестный для каждой скважины. Затем измените имя для каждого образца. Запустите эксперимент по чтению капель в качестве прямой количественной оценки при сохранении шаблона.
Обозначьте правильные экспериментальные параметры для анализа программного обеспечения, а именно информацию о выборке, супермикс, название цели, тип цели, первый канал сигнала и второй канал. Затем установите порог для количества капель выше 10 000 для получения надежных результатов. Затем проверьте количество капель для каждой скважины во вкладке капель, убедившись, что все они выше 10 000.
Наконец, проверьте амплитуду 1D для эффективного отделения сигнала от негативов. В редакторе пластин выделите всю пластину и задайте тип эксперимента для удаления. Установите целевой показатель WT в качестве эталона, обозначив первый канал для FAM и второй канал для HEX.
Установите цель NHEJ как неизвестную, обозначив первый канал для FAM, а второй канал как нулевой. На вкладке Амплитуда 2D задайте пороговые значения кластера с помощью инструментов графика для каждого образца. Хвост обычно связан с кластером WT для анализов NHEJ.
На вкладке «Передаточное отношение» нажмите на значок шестеренки в правом верхнем углу графика и выберите дробное изобилие, чтобы построить точку, соответствующую проценту событий NHEJ. 15 различных образцов по 10 комаров, каждый из которых содержал различные аллели NHEJ, были проанализированы и идентифицированы с использованием анализа сброса, и результаты показали, что все 15 образцов несли 100% аллели Инделя. В другом эксперименте 11 отобранных образцов комаров дикого типа и комаров NHEJ с различным процентом NHEJ были исследованы с помощью этого протокола ddPCR.
Результаты показали, что идентифицированный процент был сравнительно близок к обнаружению Indel методом анализа ампликонов. Пипетка медленно, чтобы избежать пузырьков, и дайте всем эмульгированным каплям капнуть вниз по стенке колодца.
