Печень является основным местом для трансплантации в клинических условиях островков человека. Внутрипеченочная трансплантация островков мыши технически сложна, и высокий процент мышей может умереть от хирургических осложнений, особенно кровотечения. В этом исследовании два метода, которые мы показали, могут эффективно предотвратить смерть мыши, вызванную кровотечением.
Наш метод может быть применен к исследованиям рака печени и других заболеваний печени, позволяя вводить раковые клетки, мезенхимальные стволовые клетки и гепатоциты непосредственно в печень. Для начала отсоедините культуру островков человека с помощью мягких царапин. Используйте шприц объемом 1 кубический сантиметр, чтобы собрать от 300 до 350 островков в стерильные 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки на льду.
Когда все островки будут собраны, центрифугируйте трубки в течение 10 секунд, чтобы отстойник клеток. Выбросьте все, кроме небольшого объема супернатанта, чтобы предотвратить потерю гранул и повторно суспендировать островки в 200 микролитрах HBSS, содержащих 5% BSA. Загрузите повторно суспендированные островки в 5-миллилитровый инсулиновый шприц и поверните иглу шприца вверх на 1 минуту, чтобы островки осели на поршени.
Нажмите на плунжер, чтобы удалить пузырьки, держа примерно от 100 до 150 микролитров раствора в шприце, и переверните шприц мягким постукиванием, чтобы равномерно распределить островки. После подтверждения отсутствия реакции на педальный рефлекс нанесите мазь на глаза, чтобы предотвратить пересыхание. Побрить брюшко анестезированной мыши, чтобы удалить мех и продезинфицировать хирургическую область тремя чередующимися салфетками 2% йода и 75% спирта.
Далее делают разрез от 1 до 1,5 сантиметра в брюшной полости и открывают брюшную полость. Поместите стерильный кусок марли вокруг разреза и используйте щипцы или ватные кончики, чтобы аккуратно перенести кишечник на марлю. Затем накройте кишечник кусочком пропитанной физиологическим раствором марли и обнажите воротную вену.
Чтобы остановить кровотечение, вызванное переносом островков, с помощью гелевой пены, удерживайте иглу скосом лицом вниз и расположите кончик иглы с отверстием параллельно стенке воротной вены перед введением иглы в воротную вену. Втяните поршень, чтобы втянуть от 20 до 50 микролитров крови в шприц, чтобы смешать с островками, прежде чем вливать островки в воротную вену, многократно угнетая и втягивая поршень. Когда все островки будут доставлены, поместите примерно 5 на 5 сантиметров кусок гелевой пены над местом инъекции.
Используйте ватный наконечник, чтобы прижать гелевую пену вниз, удаляя иглу из воротной вены. Держите гель на месте около 2 минут, раскатывая гелевую пену, чтобы убедиться, что она покрывает воротную вену. Как только кровотечение будет остановлено, осторожно верните кишечник в брюшную полость в исходное положение и введите в брюшную полость 500 микролитров теплого физиологического раствора.
Используйте швы для закрытия мышечных и кожных слоев. Затем поместите мышь в чистую клетку на грелку с контролем до полного восстановления после анестезии, вводя анальгезию каждые 12 часов и нагревая в течение 48 часов. Чтобы остановить кровотечение, вызванное переносом островков, используя жировую прокладку, после обнажения воротной вены, как показано на рисунке, используйте два ватных наконечника, чтобы удерживать открытую вену с левой и правой стороны и располагать подушечку жировой ткани между двенадцатиперстной кишкой и воротной веной.
Проникните в жировую подушку кончиком иглы перед введением в воротную вену. Вливайте островки в воротную вену, как показано на рисунке. Когда все островки будут доставлены, прижмите жировую ткань ватным наконечником примерно на 1 минуту, удаляя иглу из вены.
Затем верните кишечник в брюшную полость и выполните остальные процедуры послеоперационного ухода, как показано. Эффекты трансплантации островков зависят от дозы, так как нормальная гликемия наблюдается через 30 дней после трансплантации сингенных островков, когда переносится 500 островков, но наблюдается только временная нормогликемия при доставке 250 островков, при этом мыши возвращаются к гипергликемии через 10 дней после трансплантации. Повышенная масса тела наблюдается в обеих группах и идентичные реакции наблюдаются при пересадке человеческих островков мышам с диабетом NOD-SCID, при этом нормогликемия наблюдается при пересадке большего количества эквивалентов островков, но не меньшего количества.
Большинство мышей, у которых есть кровотечение после переноса, умирают после операции, в то время как мыши без кровотечения выживают. Через 28 дней после трансплантации окрашивание инсулином выявляет равномерное распределение островка человека по всей печени, в основном близко к кровеносным сосудам. В дополнение к инсулину, фибрин и полиморфноядерная клеточная фильтрация также наблюдаются в трансплантированных островках человека.
Внутрипеченочная трансплантация островков создаст большое отверстие в воротной вене, которое может вызвать кровотечение. Использование наших двух улучшенных процедур может предотвратить кровотечение и снизить смертность после трансплантации островков. Модель внутрипортальной трансплантации островков может имитировать клиническую трансплантацию островков человека.
Наши усовершенствованные процедуры могут привести к более высоким показателям выживаемости реципиентов, что позволяет продолжить изучение функции островков после трансплантации.
