Наш подход позволяет выполнить количественный анализ распределения Aspergillus fumigatus Conidia в цельно-монтируемом оптически очищенном легком мыши. Aspergillus fumigatus Conidia может проникать в дыхательные пути и вызывать опасные для жизни заболевания у пациентов с ослабленным иммунитетом. Дыхательные пути млекопитающих – это система дыхательных путей разных поколений.
Каждое поколение характеризуется различными структурами стенок дыхательных путей и популяций иммунных клеток. В бронхиальных ветвях aspergillus fumigatus Conidia выводится мукоцилиарным клиренсом. Однако в доступном пространстве мукоцилиарный клиренс не работает, и конидии должны быть очищены иммунными клетками, такими как альвеолярные макрофаги и нейтрофилы.
Как и пространственно-временные аспекты распределения конидий в дыхательных путях, важны. Однако неправильно исследован вопрос в понимании механизмов заболевания. Здесь мы представляем экспериментальную установку для количественного анализа распределения Aspergillus fumigatus Conidia в дыхательных путях инфицированных мышей.
Я наносил 50 микролитров меченого Aspergillus fumigatus Conidia на мышь. Через шесть часов соберите легкие. Зафиксируйте на ночь в 2%-ном формальдегиде и окрашивание с меченым конъюгатом Стрептавидина.
Затем подвергите образец оптической очистке. Поместите образец в стеклянную бутылку, наполненную 50% раствором метанола, и поместите его в смеситель для образцов при комнатной температуре в течение одного часа. Замените 50% метанол на 100% метанол и поместите его под смеситель образцов на два часа.
Готовят смесь, состоящую из одной части бензилового спирта, и двух частей бензил-бензоата. Переложите образец на него 24-й хорошей пластиной и накройте ее бензилбензоатной смесью не менее чем на 30 минут. Образец готов к визуализации.
Положите образец на держатель образца. И поместите держатель в микроскоп. После включения системы микроскопа и открытия программного обеспечения включите пропускной свет и выберите цель X.
Визуально найдите образец в пропускаемом свете и перейдите на вкладку сбора. Выберите конфокальную лазерную микроскопию Лямбда-режим. Включите соответствующие лазеры.
Установите спектральный диапазон детектора и выберите дихроичное зеркало. Отрегулируйте усиление детектора и сузьте точечный отверстие до одного блока площади. Установите разрешение пикселей 512 на 512.
Включите режим zed-стека и запустите создание изображений в реальном времени. Найдите фокальную плоскость, где видны оба кубика. Разверните панель zed-стека.
С помощью фокусировки найдите и выберите самую низкую и самую высокую плоскости образца. Расположите фокальную плоскость рядом с нижней частью образца. Выключите режим zed-стека и режим сканирования набора номера.
При необходимости отрегулируйте положение X, Y и количество плиток. Включите режимы zed-stack и сканирования набора номера. Установите шаг зед-сечения на пять микрон.
Установите скорость сканирования. Начните эксперимент. Визуализация обычно занимает несколько часов в зависимости от размера земли и скорости сканирования.
Полученное изображение затем спектрально не смешивается. Для спектрального размикширования используйте опцию линейного размешивания. Выберите регионы, соответствующие земельным участкам, обозначенным стрептавидином и конидией.
Начните размешивать. После отмены смешения сохраните несмешанный файл. Чтобы вычеркнул плитки из полученного изображения, откройте изображение.
Выберите методы геометрической строчки. Выберите изображение в окне ввода. В параметрах сшивания выберите новый вариант вывода и предохранителя плиток.
Используйте опорный режим с выбранным каналом, соответствующим флуоресценции дыхательных путей. Откройте изображение в избыточном 3D-виде. При необходимости измените цвета, используемые для их презентации.
Здесь мы показываем канал дыхательных путей в серых оттенках и канал Конидия в фиолетовом. Чтобы создать маску дыхательных путей, используйте инструмент «Добавить новую поверхность». Выберите канал дыхательных путей и выберите параметр сглаживания 10 мкм.
Для исключения сигнала из дыхательных путей могут использоваться различные фильтры. Сначала визуально осмотрите поверхность и установите порог интенсивности. Дополнительные фильтры, такие как площадь поверхности, также могут быть применены исключительно к избранным дыхательным путям, но не к плевре или кровеносным сосудам.
Далее вручную удаляют выбранный фрагмент поверхности, который не относится к дыхательным путям. Теперь вы можете наблюдать за созданной поверхностью и исследовать недостающие части, чтобы исправить их позже. Создайте маску для поверхности дыхательных путей, используя параметры редактирования и маскировки всех.
Выберите канал дыхательных путей и установите рабочие ячейки за пределами поверхности на 0,001. Здесь мы показали полученную маску в оранжевом цвете. Сохраните канал Conidia и маску дыхательных путей в двух отдельных папках, как T из серии F.
Откройте файл с изображением маски дыхательных путей. Сделайте изображение двоичным. Следуйте процессу двоичного, сделайте двоичным.
Чтобы походить по толщине маски, примените несколько расширенных 3D-функций. Следите за плагинами, обрабатывайте, расширяйте 3D. Для этого также можно использовать функциональные возможности макросов.
После нескольких циклов процесса расширения используйте функцию заполнения отверстий. Следуйте процессу, двоично, заполните дыры. Чтобы заполнить остаточные отверстия в маске вручную, откройте область менеджера интересов.
следите за анализом, инструментами, менеджером ROI. С помощью инструмента выделения полигонов выберите область, которая должна быть заполнена в одной конкретной проекции. Сделайте это несколько раз для нескольких проекций в zed-стеке, чтобы можно было интерполировать фигуры интересующих областей.
Чтобы интерполировать выбранные фигуры, выделите их все и нажмите еще, интерполируйте ROI. Затем заполните все ROI белым цветом. Повторите процедуру заполнения отверстий.
Чтобы собрать толщину маски обратно после заполнения отверстий, примените функцию erode 3D. Следуйте плагинам, обрабатывайте, разрушайте 3D. Вы также можете использовать микро для этого.
Количество итераций в erode 3D и LA 3D должно быть равным. Запустите приложение подсчета Conidia. Нажмите кнопку «Добавить файлы» и выберите папки с файлами DIFF с подготовленной маской дыхательных путей и флуоресцентными изображениями Conidia.
Установите пользовательское пороговое значение в период от нуля до единицы. Нажмите OK и посмотрите результаты. Используя этот подход, мы выполняем количественный анализ Конидий внутри и снаружи бронхиального дерева мышей через шесть часов после применения Конидии.
Данные свидетельствуют о том, что при нашем первоначальном применении большинство конидий проникают в пространство альвеол и выделяются там в начале воспалительного иммунного ответа. Трехмерная визуализация легких мыши с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии позволяет идентифицировать Aspergillus fumigatus Conidia в дыхательных путях. Обработка трехмерных изображений с использованием этого протокола позволяет проводить количественный анализ распределения конидий внутри и снаружи бронхиальных ветвей.
Наш подход также может быть использован для оценки кинетики элиминации Conidia из мышей и для сравнения анатомического распределения Conidia у иммунокомпетентных и иммунокомпрометированных мышей. Кроме того, используя этот подход, можно проанализировать распределение микрочастиц или агломератов наночастиц в дыхательных путях.
