Этот протокол позволяет исследователям точно нагревать билайер интерфейса капель, или DIB, модель мембраны, которая позволяет изучать различные связанные с температурой эффекты, которые происходят в клеточной среде. Основное преимущество связано с способностью локально измерять и контролировать температуру ванны в малооборье водохранилище, не препятствуя доступу к электрическим или оптическим характеристикам DIB. Способность точно нагревать жидкостную ванну открывает возможность изучения транспортных и сигнальных свойств в ДИБ, образованных из гораздо более широкого спектра мембранных компонентов, включая натуральные клеточные экстракты.
Это многоступенчатый протокол, использующий несколько оборудования, за которым необходимо внимательно следить для достижения достаточной экспериментальной точности, поэтому любая двусмысленность в письменном процессе может быть прояснена с помощью визуальной демонстрации. Для начала соберите два куска одномиллиметровой толщиной изолятора, обрезаемого до 25 на 40 миллиметров в длину, два куска резины толщиной шесть миллиметров, которые также 25 на 40 миллиметров, подготовленную сборку алюминиевой основы и акриловое масляное резервуар, который помещается в смотровое окно алюминиевого основания. Поместите тонкие резиновые куски на сцену микроскопа так, что длинный край каждого куска является касательным к открытию сцены.
Распоить алюминиевый базовый прибор поверх изоляционных прокладок со смотровым окном прибора, расположенным выше объектива. Поместите более толстый кусок резины поверх каждого резистивного нагревательного элемента, а затем используйте зажим для сцены микроскопа, чтобы держать его на месте, чтобы защитить нагревательные элементы от повреждений, вызванных сценическими зажимами и изолировать от случайного электрического замыкания. Тщательно согните конец измерения термокоупла, чтобы достичь 90-градусного угла на уровне около четырех миллиметров от конца.
Вставьте изогнутый кончик термокрейла в левый нижний угол алюминиевого светильника и аккуратно закрепите его запирая винтом. Поместите акриловый резервуар в колодец алюминиевого прибора до добавления гексадеканового масла в колодец алюминиевого прибора, чтобы свести к минимуму риск захвата пузырьков воздуха между смотровым окном и дном акрилового резервуара. Раздай около 1000 микролитров гексадеканового масла в колодец алюминиевого прибора, чтобы обеспечить максимальную площадь поверхности для передачи тепла, не позволяя нефти разливаться по краям прибора на стадии микроскопа или объектива.
Выдай около 1000 микролитров гексадеканового масла в акриловый резервуар, не переполнив его. Измерьте номинальную емкость мембраны при одновременном снижении температуры масляной ванны с установленной точки, которая позволяет двухслойное образование определить термотропные фазы переходов липидов в мембране. Нажмите правой кнопкой мыши на графике температуры в графическом интерфейсе и очистите данные дисплея, чтобы обеспечить достаточное пространство в буфере для последующих записей.
Используя генератор волновой формы, подключенный к усилителю зажима патча, нанесите треугольную волновуюформу напряжения через билайер интерфейса капли, или DIB, электроды и записывают индуцированную реакцию тока через билайер. Охладить билейер, снизив температуру установленного уровня на пять градусов, ожидая минимум пять минут при новой температуре стабильного состояния между изменениями температуры до достижения желаемой температуры. После масляной ванны и охлаждения бислой до нужной минимальной температуры, право нажмите график температуры в GUI снова и экспортировать данные о температуре по сравнению со временем в электронную таблицу программного обеспечения.
Остановите текущую запись. Из измеренного тока вычислите номинальную емкость квадратной волны текущей реакции по сравнению со временем в период охлаждения. Участок номинальной емкости по сравнению с температурой, чтобы наблюдать, как мембранная способность изменилась, а затем найти не монотонные изменения в емкости по сравнению с температурой для определения температуры плавления.
Аналогичным образом, оценить квази статической специфической емкости билейера при фиксированных температурах путем последовательного увеличения температуры масляной ванны и площади билейера. Измените температуру установленного пункта на 10 градусов по Цельсию с помощью графического интерфейса и позвольте системе уравночные доработать новую температуру. Выполните ранее описанные шаги по инициированию измерения емкостного тока и записи.
Измените область билейера, тщательно регулируя положение электродов с помощью микроманипуляторов. Разрешить для квадратного волнового тока, чтобы достичь стабильного состояния амплитуды и собирать изображения DIB, чтобы позволить расчет области мембраны по сравнению со временем. Используйте камеру, установленную на микроскоп, чтобы изображение бислойщика, как видно из диафрагмы.
Одновременно добавьте цифровой тег в текущее программное обеспечение для записи, чтобы отметить соответствующую точку времени для сбора изображений. Получить в общей сложности пять DIB изображений и устойчивых состояний регионов билейного тока, а затем сбросить температуру и повторить изображение. Проанализируйте текущие записи и изображения DIB в отмеченных точках времени, соответствующих устойчивым областям двухслойного состояния, емкости и площади экстракта двухслойных 3000 для каждой температуры.
Емкость участка по сравнению с областью для каждой температуры и вычислить наклон регрессии первого порядка, которая представляет собой специфическую емкость билейера при каждой температуре. Затем построения значений конкретной емкости по сравнению с их соответствующими температурами. Изучите конкретные данные о емкости по сравнению с температурой для не монотонных вариаций для определения температуры плавления.
Оцените динамику формирования ионных каналов, зависящих от напряжения, генерируя ввод шага dc через билейер. Установите начальное напряжение до желаемого значения шага в милливольтах и окончательного напряжения и размера шага до значения выше желаемого шага. Установите желаемое время длительности для ввода шага в считанные секунды, а затем выберите желаемую полярность для ввода шага.
Включите усилитель зажима патча, чтобы отправить командное напряжение, возникают из лабораторного представления или модуля вывода напряжения на головную сцену, включите напряжение и замитвайте индуцированную реакцию тока, которая должна препятствовать S-образной реакции на критическое напряжение. Отдельно получить динамические отношения текущего напряжения для мембраны при желаемых температурах, чтобы выявить напряжение-зависимых отношений, таких как поведение ионных каналов. Переключите усилитель зажима патча, чтобы отправить командное напряжение, возникают из генератора волновой формы, на головную сцену и инициировать текущие записи.
На генераторе волновой формы выводится непрерывная синусоидальная волновая форма с желаемой амплитудой, смещением и частотой. Завехать индуцированную текущую реакцию в течение одного или нескольких циклов и повторить по желанию для различных амплитуды синусной волны, частоты и температуры. Система контроля температуры была использована для демонстрации температурной зависимости DIB формируется из мозга общего липидного экстракта, или BTLE, липиды.
Измерения емкостного тока и температуры по сравнению со временем показаны во время отопительного цикла от комнатной температуры до примерно 60 градусов по Цельсию. Были зафиксированы изменения номинальной емкости по сравнению с температурой в течение одного полного цикла охлаждения/нагрева, после первоначального образования двухслойного на уровне 60 градусов по Цельсию. Квази-статические измерения специфической емкости при различных температурах могут быть использованы для определения температуры плавления липидов.
Построение емкости области бислойца по сравнению с областью билейера позволяет осуществлять линейную регрессию, когда наклон представляет значение конкретной емкости. Изображение DIB показывает, что, когда температура ниже температуры плавления, мембрана принимает высоко клейкое состояние, даже под напряжением от растянутых капель, вызванных хорошо разделенными электродами. Показанные следы тока и напряжения были получены путем применения напряжения синуоидной мембраны, измерения индуцированного тока при двух различных температурах.
Стрелки и последующие числа помогают визуализировать последовательные четверти синусоидального напряжения по отношению к времени. Измеренная плотность тока для моназомицин-допинг BTLE мембраны на том же уровне напряжения и двух различных температур показано здесь. Очень важно правильно распределить гексадекановое масло в колодец алюминиевого прибора.
Если это делается из последовательности или не тщательно, пузырьки воздуха образуются под акриловой хорошо, что будет препятствовать снизу вверх зрения DIB. Пользователь должен также помнить, чтобы очистить буфер данных в программном обеспечении контроля температуры до каждого измерения, чтобы обеспечить полную запись. Эта процедура позволяет охарактеризовать биомиметические мембраны по широкому диапазону температур, что необходимо для изучения температурной зависимости мембранной структуры и транспорта.
Кроме того, эта возможность может быть использована дляявить наномасштабное воздействие других мембранных активных видов, таких как биологические ионные каналы и инженерные наноматериалы.
