Наш протокол описывает подробные методы изготовления и анализа 3D-культуры микроткани скелетных мышц человека. Мышечные микроткани могут быть применены для исследований базовой мышечной биологии, моделирования заболеваний или для тестирования молекул-кандидатов. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет на месте оценивать сократительную силу и переходные процессы кальция.
Из-за этого можно проводить продольные исследования функции мышечной ткани. Демонстрировать процедуру будут Бреннен Масгрейв и Хета Лад, аспиранты моей лаборатории. За два-три часа до посева клеток поместите шесть хорошо мягких тактических пластинок в 10-сантиметровую чашку для культивирования клеток.
Хорошо подготовьте каждую отдельную миотактическую культуру, добавив 100 микролитров 5%-ного плуронического раствора F-127. Используйте крышку, чтобы покрыть колодцы, и нанесите парафиновую пленку, чтобы запечатать блюдо. Центрифугируйте блюдо при 1 550 G в течение одной минуты в центрифуге, оснащенной адаптером пластинчатого спиннера.
Храните культуральную посуду при четырех градусах Цельсия до тех пор, пока клетки не будут готовы к посеву. Затем медленно оттаивают 150 микролитров аликвоты экстракта базальной мембраны и 110 микролитровых аликвот тромбина на льду в культуральной вытяжке. Работая в вытяжке клеточной культуры, добавьте 700 микролитров 0,9% физиологического раствора в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую семь миллиграммов порошкообразного фибриногена.
Поместите трубку в инкубатор клеточной культуры при температуре 37 градусов Цельсия на три-пять минут без вихрей. Аккуратно извлеките и проведите трубкой, затем импульсно раскрутите растворенный раствор в микроцентрифуге, прежде чем вернуть его в культуральную вытяжку. Фильтруйте раствор фибриногена с помощью одного миллилитра шприца, оснащенного шприцевым фильтром 0,22 микрометра.
Затем перенесите растворенный раствор фибриногена на лед вместе с экстрактом базальной мембраны и аликвотами тромбина. Подготовьте и предварительно нагрейте тканевую питательную среду при 37 градусах Цельсия, которая будет введена в культуральные лунки после посева тканей. Извлеките пластины для культивирования клеток из инкубатора и аспирируйте культуральную среду.
Затем промыть клетки один раз, добавив пять миллилитров DPBS в каждую культуральную пластину. Аспирируйте DPBS и отделяйте клетки, добавляя один миллилитр 0,25% трипсина ЭДТА в каждую культуральную чашку. Поместите тарелку в инкубатор клеточных культур в течение трех минут, удерживайте трипсин, добавив три миллилитра моющего средства в чашку для культивирования, затем перенесите клетки в коническую трубку соответствующего размера.
Гранулируют клетки центрифугированием в 400 раз G в течение 10 минут. Тщательно аспирируйте среду, не повреждая клеточную гранулу, затем повторно подвешивайте клетки в одном миллилитре промывной среды. Подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра и трипанового синего красителя под яркой полевой микроскопией.
Чтобы засеять шесть тканей, подготовьте достаточное количество клеток и внеклеточного матрикса для восьми тканей, таким образом, учитывая потери и образование пузырьков. Переложите 1,2 миллиона клеток в новую коническую трубку, затем увеличьте объем до 10 миллиметров с помощью промывочной среды. Гранулируют клетки центрифугированием в 400 раз G в течение 10 минут.
Приготовьте 150 микролитров смеси ECM в 1,5-миллилитровой микроцентрифужной трубке и храните смесь на льду до использования. Аспирируйте среду из конической трубки, содержащей клетки, заботясь о том, чтобы избежать клеточной гранулы. Энергично проведите пальцем в перчатке концом трубки, пока гранула не появится в виде клеточной суспензии.
Перенесите 120 микролитров раствора ECM в трубку, содержащую клеточную суспензию, и осторожно пипетку вверх и вниз, чтобы полностью повторно приостановить ячейки внутри ECM для получения одноклеточной суспензии. Избегайте образования пузырьков, затем поместите клеточную суспензию ECM на лед до использования. Поместите охлажденную 10-сантиметровую чашку, содержащую миотактические колодцы, поверх пакета со льдом внутри вытяжки для культивирования клеток и аспирируйте плуронический раствор F-127 из каждой лунки.
Дайте остаточному плуроническому раствору F-127 освободиться из пористой PDMS и осесть на дно скважины, дав скважинам посидеть в течение пяти минут на льду, а затем снова аспирировать. Аккуратно прикрепите ячейку ECM-суспензией, чтобы повторно приостановить ячейки, затем перенесите 105 микролитров суспензии в свежую, предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую трубку, захватив ее близко к верху. Добавьте 0,84 микролитра по 100 единиц на миллилитр раствора тромбина к 105 микролитрам клеточной суспензии ECM.
Пипетку быстро и тщательно перемешать, избегая введения пузырьков. Добавьте 15 микролитров клеточной ECM-смеси в каждую лунку, не вдавливая пипетку в дно скважины. Двумя легкими движениями распределите клеточную суспензию за каждым столбом в колодце.
Поместите крышку на 10-сантиметровую культуральную пластину и перенесите ее в инкубатор для культивирования тканей при температуре 37 градусов Цельсия примерно на пять минут. Добавьте 200 микролитров предварительно нагретой тканевой питательной среды в каждый миотаксический колодец после полимеризации клеточной ECM-смеси. Замените крышку на 10-сантиметровую посуду и держите ее в инкубаторе до дифференциации.
В течение 14-дневного периода культивирования миобласты демонстрировали аспекты нативной ткани, самоорганизуясь в мягкой тактике, чтобы сформировать 3D-микротизлю с многоядерными полосатыми миотрубами. Миотубы имеют саркомерные полосы, которые были визуализированы путем иммуноокрашивания саркомерного альфа-актинина. Для достижения хорошо выровненных миотубов следует избегать технических ошибок, таких как образование пузырьков при пипетке или повреждение плуронового покрытия во время аспирации.
Здесь показано репрезентативное смещение пластинки миотаксического колодца в ответ на низкочастотную и высокочастотную электрическую стимуляцию, что указывает на то, что миотрубы реагируют на изменяющиеся электрические раздражители и соответственно сокращаются. Количественная оценка пост-смещения позволяет преобразовать в абсолютную сократительную силу ГММТ. В ответ на низко- и высокочастотную стимуляцию также анализировали переходную способность кальция на ГММТ, изготовленные из GCaMP6-трансдуцированных миобластов.
Количественная оценка интенсивности флуоресцентной жидкости может быть использована в качестве измерения свойств обработки кальция ГММТ. Большинство людей, которые выполняют этот посев тканей впервые, борются с добавлением клеточного внеклеточного матрикса в лунки и с образованием пузырьков. Мы рекомендуем практиковать методику на некоторых запасных колодцах для культивирования микротюса с очень простым вязким раствором перед первой попыткой с клетками.
