Наш зонд и протоколы FRET позволяют быстро и чувствительно количественно оценивать активность свободной и поверхностно связанной эластазы и катеспина G в мокроте у пациентов с нейтрофильными заболеваниями дыхательных путей. Эти методы, позволяют исследовать различные аспекты патофизиологии протеаз. Измерения считывателя пластин позволяют проводить большие просеивания.
Конфокальная микроскопия визуализирует активность ферментов с помощью субклеточного раствора. В то время как проточная цитометрия позволяет персонализированным образом количественно определять фенотипирование и активность протеазы. Этот метод может быть распространен на различные заболевания дыхательных путей, такие как муковисцидоз, бронхоэктазы или ХОБЛ.
И он может быть адаптирован к различным биопротезам, таким как кровь или бронхиальная альвеола лаваш или образцы мышей. Перед началом процедуры индукции мокроты вдохните 200 мкг антагонистов бета-2 рецепторов сальбутамола. После этого вдыхайте гипертонический 6% физиологический раствор в течение 15 минут с помощью небулайзера.
Соберите отхаркившую мокроту в чашку Петри. Отделите сгустки слизи из слюны в чашку Петри с помощью кончика пипетки. Взвесьте слизь, затем добавьте в мокроту четыре объемные части на вес 10% Спутолизина и ПБС.
Инкубировать смесь при комнатной температуре на качающей шейкере в течение 15 минут, чтобы растворить слизь. Утвеняют реакцию добавлением одного миллилитра холодного PBS на каждый миллилитр 10% Спутолизина. Пипетку смеси для получения однородного раствора.
Отфильтруйте смесь через 100-микроновый нейлоновый клеточный сетчатый фильтр в 50-миллилитровую трубку. Повторите этап фильтрации через 40-микроновый сетчатый фильтр, затем центрифугируют в течение 10 минут при 300 G при четырех градусах Цельсия. Переложите супернатант в свежую трубку и храните на льду.
Аккуратно повторно суспендируйте гранулу ячейки в 500 микролитров холодного PBS и поместите ее на лед. Разморозить ферменты на льду и установить стандартную кривую ферментов, как описано в рукописи текста. Параллельно со стандартным препаратом разводят образцы мокроты в буфер активации.
На пластине считывателя устанавливают длину волны возбуждения для зонда NE FRET NEmo-1 до 354 нанометров, а длину волны излучения до 400 нанометров для донора и 490 нанометров для акцептора. Для зонда CG FRET sSam установил длину волны возбуждения на 405 нанометров, а излучение на 485 нанометров для донора и 580 нанометров для акцептора. Добавьте 40 микролитров образцов, эталонов или заготовок в колодцы черной пластины площадью 96 скважин и добавьте мастер-микс.
Запустите считыватель пластин и запишите увеличение соотношения донора к акцептору через каждые 60-90 секунд в течение не менее 20 минут или до тех пор, пока увеличение сигнала не достигнет плато. Экспортируйте данные и рассчитайте соотношение донора к акцептору, разделив донор РФС на акцептор РФС для каждой точки времени и выборки. Затем рассчитайте среднее отношение донора к акцептору и стандартное отклонение.
Определите наклон в пределах линейного роста изменения соотношения донора к акцептору. Для каждого измерения повторно суспендирует 30 000 клеток мокроты в объеме 50 микролитров PBS в трубке размером 1,5 миллилитра. Инкубируют клетки мокроты специфическим ингибитором в качестве отрицательного контроля и соответствующим ферментом в качестве положительного контроля в течение 10 минут при комнатной температуре.
Добавьте 50 микролитров PBS, содержащих репортер FRET и ядерное пятно, в каждую трубку, чтобы получить окончательную концентрацию 2 микромоляра. Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 10-20 минут. Погасите реакцию, добавив 100 микролитров ледяного PBS и поместите образцы на лед.
Цитоспин смеси на микроскопических слайдах. Затем высушите на воздухе и зафиксируйте ячейки ледяным холодом 10% метанола в течение 10 минут. После фиксации высушите на воздухе и смонтируйте образец с помощью соответствующей монтажной среды.
Делайте снимки с помощью конфокального микроскопа. Изображение не менее 100 ячеек на условие для окончательной статистики. Повторно суспендировали 1 миллион клеток в 100 микролитрах PBS в пятимиллилитровой полистирольной трубке FACS с круглым дном и поместите трубку на лед.
Добавьте два микролитра блока FC к каждому образцу. Затем инкубируют образцы в течение пяти минут при комнатной температуре. Добавьте антитела в каждую пробирку и инкубируют на льду в темноте в течение 30 минут.
Промыть ячейки двумя миллилитрами холодного PBS и центрифугой в 300 раз G и четыре градуса Цельсия. Наконец, повторное суспендирование в 200 микролитров PBS. Разделите суспензию на две трубки, по 100 микролитров в каждой и добавьте пять микролитров пятна жизнеспособности клеток.
Добавьте соответствующий специфический ингибитор NSP в отрицательную контрольную трубку и инкубируйте образец в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Добавьте PBS в образец и отфильтруйте его через 40-микроновый фильтр в чистую трубку FACS. Добавьте репортер в отрицательную контрольную выборку и осторожно вихрь.
Начните приобретать клетки, инкубированные с этим специфическим ингибитором, и при необходимости слегка отрегулируйте затворы, а также репортерные напряжения PMT. Чтобы записать изменения в доноре, чтобы принять соотношение из-за активности протеазы, связанной с мембраной, записывайте 1000 нейтрофилов из каждой трубки каждые пять-10 минут. Рассчитайте коэффициент FRET, разделив донора на значения акцепторного канала для образцов, измеренных на закрытых жизнеспособных одиночных нейтрофилах.
Здесь показаны изображения нейтрофилов, предварительно инкубированных со 100 микромоляльными сивилестатами или оставленных без лечения до добавления репортера NEmo-2. Ядерный сигнал использовался для идентификации нейтрофилов по их характеристикам сегментированных ядер и ROI выбирался вручную. Донору было положено на прием соотношение нейтрофилов мокроты.
Каждая точка представляет собой среднее значение одной рентабельности инвестиций. Проточная цитометрия позволяет различать и изучать нейтрофилы мокроты. Распределение МФО на нуле и 10 минут наблюдалось после добавления репортера.
Рассчитаны средние значения донорской и акцепторной МФО для 1000 нейтрофилов мокроты. Коэффициент D/A достиг плато после первоначального увеличения. Индукция мокроты здоровых доноров требует некоторой практики перед совершенством.
Не забудьте расслабиться и дышать аэрозолем в течение 10-15 минут перед отхаркиванием. Кроме того, всегда сохраняет клетки мокроты на льду и обрабатывает их как можно скорее после отхаркивания. Мы обнаружили, что поверхностно-связанная активность протеазы коррелирует с ранним повреждением легких у детей и с тяжестью заболевания легких у взрослых пациентов с муковисцидозом.
Таким образом, вместе эти методы позволяют исследовать протеазы как ранние биомаркеры воспаления при нейтрофильных заболеваниях дыхательных путей.
