Этот протокол приводит к воспроизводимой и надежной экстракции хроматина из замороженных образцов печени для экспериментов по иммунопреципитации хроматина. Для начала поместите пробирку с замороженной тканью в ступку и оставьте ее там на пять минут. Затем надавите на образец с помощью предварительно охлажденного пестика до тех пор, пока не исчезнут твердые крошки.
Извлеките пробирку с образцом из раствора. Добавьте 950 микролитров ледяного PBS с необходимыми ингибиторами и аккуратно пипеткой вверх и вниз, пока образец полностью не ресуспендируется. Немедленно перенесите тканевую суспензию в гомогенизатор и нанесите от 20 до 30 ударов пестиком А, чтобы получить более тонкую суспензию.
Избегайте перемещения пестика за пределы жидкой фазы, чтобы предотвратить пенообразование. Переложите гомогенат в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра, предварительно охлажденную на льду. Затем центрифугируйте пробирку в течение пяти минут при температуре 1,300 G и четырех градусах Цельсия.
Осторожно удалите надосадочную жидкость и полностью ресуспендируйте гранулы в 950 микролитрах PBS комнатной температуры путем осторожного пипетирования. Затем добавьте 63,6 микролитра 16%-ного формальдегида, не содержащего метанола, до получения конечной концентрации 1%Немедленно поверните пробирку на 10 минут при комнатной температуре. После вращения добавьте 113 микролитров 1,25 молярного глицина при комнатной температуре, чтобы получить конечную концентрацию 125 ммоляр, и вращайте пробирку еще пять минут.
Затем центрифугируют образец при температуре 1 300 г в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от надосадочной жидкости и осторожно ресуспендируйте гранулы, пипетируя 950 микролитров ледяного PBS с необходимыми ингибиторами. Снова центрифугируйте образец и ресуспендируйте гранулу, как показано ранее.
Повторите этап центрифугирования еще раз и сразу же приступайте к процедуре выделения хроматина. Добавьте в гранулу 950 микролитров буфера А с необходимыми ингибиторами и аккуратно перемешайте пипеткой до тех пор, пока гранула полностью не ресуспендируется. Затем вращайте трубку в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
После вращения центрифугируют образец при 2 000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и осторожно удаляют надосадочную жидкость. Добавьте в гранулу 950 микролитров буфера B с необходимыми ингибиторами и аккуратно перемешайте пипеткой до полного ресуспендирования гранулы. Затем вращайте трубку в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
После вращения снова центрифугируйте образец. Удалите надосадочную жидкость. Затем добавьте 300 микролитров буфера С комнатной температуры с необходимыми ингибиторами в гранулу и энергично пипетку.
Встряхните образец в течение 15-30 секунд. Затем ненадолго покрутите тюбик, чтобы собрать капли на крышке. После обработки ультразвуком образца хроматина добавьте 30 микролитров 10% раствора Triton X-100 и встряхните в течение пяти-10 секунд.
Центрифугируют образец при 16 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. И переложите надосадочную жидкость в чистую пробирку объемом 1,5 миллилитра, предварительно охлажденную на льду. Перенесите от 10 до 25 микролитров измельченного хроматина в новую пробирку и добавьте буфер C, чтобы достичь конечного объема в 200 микролитров.
Аликвота и шок заморозьте остаток хроматина при температуре минус 80 градусов по Цельсию до дальнейшего использования. Добавьте восемь микролитров пятимолярного хлорида натрия и выдерживайте не менее шести часов при температуре 65 градусов Цельсия в нагревательном блоке, встряхивая при 1,000 об/мин. По возможности продлите инкубацию на ночь.
После того, как образцы остынут при комнатной температуре в течение пяти минут, добавьте два микролитра РНКазы А и инкубируйте в течение одного часа при 37 градусах Цельсия, встряхивая при 1000 об/мин. Извлеките образцы из нагревательного блока и добавьте семь микролитров 300 миллимоляров хлорида кальция и два микролитра протеиназы К. Инкубируйте образцы в нагревательном блоке при температуре 56 градусов Цельсия в течение 30 минут, встряхивая при 1 000 об/мин. Между тем, подготовьте одну пробирку для разделения фаз для каждого образца, центрифугируя их до 16 000 G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия.
Вынув пробирки из нагревательного блока и дав им уравновеситься при комнатной температуре в течение трех минут, перенесите 400 микролитров образца в предварительно центрифугированную пробирку для разделения фаз. Затем добавьте 400 микролитров раствора изоамилового спирта фенолхлороформа и встряхните в течение пяти секунд. Центрифугируйте пробирку при 16 000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Затем добавьте 400 микролитров хлороформа и встряхните в течение пяти секунд. Центрифугируйте пробирку еще пять минут и перенесите 400 микролитров верхней фазы в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра, которая содержит 24 микролитра пятимолярного хлорида натрия и 0,75 микролитра гликогена. Затем ненадолго закрутите трубку.
Добавьте 1 055 микролитров 100% этанола. Затем тщательно перемешайте и инкубируйте образец при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение одного часа или при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение ночи. После завершения инкубации центрифугируют образец при 16 000 г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия и осторожно удаляют надосадочную жидкость, не вывихивая гранулы.
Добавьте 500 микролитров холодного 70% этанола и осторожно наклоните трубку, чтобы гранулы были промыты. Центрифугируйте пробирку при 16 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Осторожно удалите всю надосадочную жидкость и дайте гранулам высохнуть при комнатной температуре.
Кроме того, инкубируйте пробирку при температуре 37 градусов Цельсия для более быстрого высыхания. Добавьте 50 микролитров раствора Tris-EDTA и поместите трубку на нагревательный блок на пять-10 минут при встряхивании при 300 об/мин. Затем проанализируйте ДНК на 1%-ном агарозном геле.
После декросслинкинга хроматина и визуализации ДНК на агарозном геле успешный сдвиг можно распознать по наличию фрагментов в диапазоне от 100 до 300 пар оснований. Хроматин был успешно осажден антителами триметилирования H3K4, ацетилирования H3K27 и триметилирования H3 K27 и дальнейшего анализа с помощью кПЦР. Хромосома одна открытая рамка считывания 43, субъединица протеасомы 20S бета два и области промотора глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, которые активно транскрибируются в печени, показали обогащение триметилированием H3K4 и ацетилированием H3K27.
Для сравнения, гомеобокс С13, гомеобокс С12 и промоторные области промотора фактора транскрипции миелина мыши, которые подавляются в печени, не были обогащены, как ожидалось. Триметилирование H3 K27 демонстрирует противоположное поведение, тем самым подтверждая успех иммунопреципитации хроматина или анализа ChIP. Хроматин был успешно подвергнут ChIP-Seq.
После секвенирования тростник выравнивали по заранее подготовленному индексу и разделяли по видам. Триметилирование H3K4 и осаждение ацетилирования H3K27 в начальных сайтах транскрипции генов, как и ожидалось, антагонизировалось с осаждением триметилирования H3K27. Кластер Hox C известен тем, что транскрипционно неактивен как в печени мышей, так и в печени человека.
Профилирование триметилирования H3K4 и ацетилирования H3K27 показывает пики для этих двух посттрансляционных модификаций за пределами кластера, в то время как интенсивность сигнала триметилирования H3K27 имеет тенденцию увеличиваться в кластере генов. Экстракция хроматина из замороженных образцов тканей имеет высокую внутреннюю изменчивость, сильно зависящую от тонкости клеточной суспензии и температуры во время сшивания. Обеспечение фиксированных лабораторных условий помогает поддерживать воспроизводимость диапазона размеров фрагментов.
