Этот метод используют флуоресценцию, чтобы определить, переносится ли белок на биологически важные ликиды между синтетическими мембранами и, таким образом, способствует распределению этих липидов внутри эукариотических клеток. Этот метод позволяет экстракцию и транспортировать природный липид с помощью белка, для этого требуется и флуоресценция клеток, и липосом, которые легко сделать. Этот метод может быть использован и модифицирован, чтобы получить представление о клеточной биологии белками, стоящими за распределением некоторых важных липидов между органом и мембранами.
Визуальная демонстрация имеет решающее значение для объяснения того, как выполнять измерения переноса липидов в режиме реального времени флуоресценцией. Таким образом, продемонстрировать процедуру также будет Мод Магделейн, инженер моей лаборатории. Начните с приготовления свежего фильтрованного и дегазированного буфера ацетата калия HEPES, дополненного одним миллимолярным хлоридом магния с образованием буфера HKM.
Затем готовят липосомы, изготовленные только из ПК или дополнительно легированные двумя молярными процентами PS или PI(4)P. Теперь поместите колбу на вращающийся испаритель, чтобы высушить липиды под вакуумом. В одной лунке смешайте липосомы, содержащие два молярных процента PS, с липидным датчиком NBD-C2 Lact до конечной концентрации 250 наномолярных и объемом 100 микролитров.
Заполните вторую скважину таким же количеством липосом и лакта NBD-C2, смешанного с тремя микромолярными белками переноса липидов или LTP. Заполните третью скважину 250 наномолярными лактами NBD-C2, смешанными с чистыми 80 микромоллярными липосомами PC, а четвертую скважину чистыми 80 микромолярными ЛИПОСОМАМИ PC. Повторите эти шаги, чтобы подготовить три дополнительные серии из четырех скважин.
Затем поместите многоязыковую пластину в флуоресцентный считыватель. Для каждой скважины регистрируют спектр NBD от 505 до 650 нанометров с пятинанометровой полосой пропускания при возбуждении при 490 нанометрах при 25 градусах Цельсия. Для каждого ряда вычтите спектр, записанный только с липосомами из других спектров.
Для экстракции PI(4)P готовят липосомы, легированные двумя молярными процентами фосфатидилинозитол-4-фосфата, и проводят измерения с помощью зонда NBD-PH FAPP. Выполните контрольные эксперименты и определите процент извлечения. После окончания экструдирования липосомы заполняют тюбик этими экструдированными липосомами.
Приготовьте свежеотмазывённый и отфильтрованный буфер HKM и держите трубки, содержащие экструдированные липосомы, при комнатной температуре. Оберните трубки, содержащие липосомы, с родамином, меченым фосфатидилэтаноламином, в алюминиевую фольгу и храните их в непрозрачной коробке, чтобы предотвратить любое фотоотбеливание. Установите температуру между 25 и 37 градусами Цельсия и отрегулируйте монохромметры возбуждения до 460 нанометров с короткой полосой пропускания от одного до трех нанометров и излучением до 530 нанометров с большой пропускной способностью более 10 нанометров.
Установите время сбора на двадцать пять минут с разрешением по времени не более одной секунды. В кварцевой кювете разводят 30 микролитров суспензии липосом LA и раствора лакта NBD-C2 и предварного буфера HKM для приготовления образца объемом 570 микролитров, который содержит 200 микромолярных общих липидов и 250 наномолярных или NBD-C2 лакт. Добавьте небольшую магнитную мешалку и поместите кювету в держатель флуорометра.
Как только образец будет термически уравновешиваться, запустите измерение. Через одну минуту добавьте в образец 30 микролитров суспензии липосом LB. Через три минуты вводят LTP в образец так, чтобы конечная концентрация LTP была 200 наномоляров, затем получают сигнал в течение оставшихся 21 минуты.
Провести параллельный эксперимент по нормализации сигнала NBD. Смешайте 30 микролитров равновесной липосомной суспензии LA с 250 наномолярными лактами NBD-C2 в буфере HKM при конечном объеме 570 микролитров. Через одну минуту вводят 30 микролитров равновесной липосомной суспензии LB.
Преобразуйте кинетические кривые, измеренные с интересующим LTP, чтобы определить количество PS, переданных из LA в ЛИПОСОМы LB с течением времени. Затем нормализуйте каждую точку данных кривой. Выполните эксперимент PI(4)P, используя те же настройки и условия излучателя пола, что и для анализа передачи PS.
В кювете смешайте 30 микролитров суспензии липосом lb и зонд NBD-PH FAPP с предварительно нагретым буфером HKM для получения конечного объема 570 микролитров. Как только тепловое равновесие образца достигнуто, начните измерение. Через одну минуту вводят 30 микролитров суспензии липосом LA.
Через три минуты ввести интересующих LTP и записать сигнал. Выполните второй эксперимент для нормализации сигнала NBD. Смешайте 30 микролитров равновесной липосомной суспензии lb с 250 наномолярами NBD-PH FAPP и 570 микролитрами буфера HKM.
Через одну минуту вводят 30 микролитров равновесной липосомной суспензии LA. Преобразуйте кинетические кривые для определения количества PI(4)P, передаваемых от LB к LA липосомам с течением времени, затем нормализуйте каждую точку данных. Для количественной оценки того, в какой степени LTP является эффективным.
Выполните линейную регрессию первых точек данных кинетики переноса для получения наклона. Разделите значение наклона на концентрацию LTP в реакционной смеси, чтобы определить количество молекул липидов, переносимых на белок за единицу времени. Эффективное восстановление лакта C2 из бусин было проверено с помощью анализа страниц SDS.
Ультрафиолетовый видимый абсорбирующий спектр C2 лакта, меченый NBD, подтвердил, что все молекулы лакта C2 были помечены группой NBD. Чистоту лакта NBD-C2 и его флуоресценцию определяли методом анализа страниц SDS. Флуоресценция лакта NBD-C2 или NBD-PH FAPP была максимальной, когда для инкубации использовались только липосомы, содержащие PS или PI(4)P, что указывает на то, что датчик был связан мембраной.
Низкая флуоресценция наблюдалась, когда присутствовал Osh6p, что указывает на то, что этот белок эффективно извлекал PS или PI(4)P из липосом. Показаны результаты анализа передачи PS с использованием Osh6p в качестве LTP. Рассчитаны средние кинетические кривые переноса PS от липосом LA к липосомам LB, легированные или не легированные фосфатидилинозитол-4-фосфатом.
Средняя начальная скорость переноса PS была определена из трех различных экспериментов. Аналогично, здесь показаны результаты анализа передачи PI(4)P с использованием Osh6p в качестве LTP. Наряду со средними кинетическими кривыми, полученными после нормализации сигнала.
Средние скорости передачи измеряли с помощью липосом LA, которые были легированы или не легированы PS. При выполнении этого протокола используйте свежий буфер и готовьте те же дни. Сведите к минимуму легкую экспозицию флуоресцентных липосом и белков, используйте хорошо очищенный белок, меченый NBD, и держите их на льду. может быть подтверждено путем измерения переноса PS и PI(4)P между органеллами внутри прокариотической клетки с использованием генетически закодированных флуоресцентных липидных датчиков.
Этот метод прокладывает путь к лучшему пониманию PS и PI(4), распределенных внутри клетки, и их активность подвергается специфичности нескольких LTPS.
