Это исследование представляет собой протокол для дифференциации нейронных клеток-предшественников исключительно индуцированных стимуляцией прямого тока импульса в микрофлюидной системе. Этот метод обеспечивает полезный подход для сокращения экспериментального времени установки, объема выборки и объема реагентов. Кроме того, чип МЧС подходит для наблюдений за конфокальцией.
Простое лечение прямого тока импульса может контролировать мышь нервных клеток-предшественников и может быть использован для разработки терапевтических стратегий для расстройства нервной системы. Для начала нарисуйте шаблоны для отдельных слоев PMMA и двустороннюю ленту с использованием соответствующего программного обеспечения. Включите лазерный писец углекислого газа и подключите его к персоному компьютеру.
Откройте разработанный файл шаблона с помощью программного обеспечения. Поместите листы PMMA или двустороннюю ленту на платформу лазерного писца, затем сосредоточьте лазер на поверхности листов PMMA или двустороннюю ленту с помощью инструмента автофокусировки. Выберите лазерный писец в качестве принтера, а затем используйте лазерный писец, чтобы начать прямую абляцию на листе PMMA или двустороннюю ленту.
Снимите защитную пленку с листов PMMA и очистите поверхность с помощью азотного газа. Для склеивания нескольких слоев листов PMMA, стек три куска одного миллиметра PMMA листов и склеить их под давлением пять килограммов на квадратный сантиметр в тепловой связующий в течение 30 минут при 110 градусах по Цельсию, чтобы сформировать поток или электрической стимуляции канала сборки. Придерживайтесь 12 частей адаптеров к отдельным отверстиям в слое один из МО чип сборки с быстро действующим цианоакрилатом клея.
Дезинфицировать один миллиметр PMMA субстраты, двусторонняя лента, и три миллиметра оптического класса PMMA с помощью ультрафиолетового облучения в течение 30 минут до сборки чипа. Придерживайтесь одномиллиметровых субстратов PMMA на трехмиллиметровой оптической ПММА с двухсторонней лентой для завершения сборки PMMA. Придерживайтесь очищенного стеклоочистительного стекла к сборке PMMA с помощью двухсторонней ленты.
Печать отверстия адаптеров агар моста с белыми пальцами герметики пробки. Подключите плоский нижний разъем к сборке чипов MOE через средние входные и розетки адаптеры, а затем подключить конус Luer адаптер к трех-путь стопкоков. Добавьте два миллилитров раствора 0,01%PLL с помощью трехмиллилитрового шприца, который подключается к трехмерной стопкок среднего входе, и подключите пустой трехмиллилитровый шприц к трехмерной стопкок средней розетки.
Заполните области клеточной культуры раствором PLL и медленно перекачиваем раствор покрытия туда-сюда. Закройте два трехголохолки, чтобы запечатать решение внутри культурных регионов. Инкубировать чип МЧС при 37 градусах по Цельсию за ночь в инкубаторе, наполненном 5%-ным углекислым газом.
Откройте два трехкую стороны стопкоков и смыть пузырьки в каналах вручную накачки покрытия раствор взад и вперед в канале с помощью двух шприцев. Нарисуйте три миллилитров полной среды в трехмилитрный шприц, который соединяется с трехмерным стопкоком среднего входного и добавьте его, чтобы заменить раствор покрытия в регионах клеточной культуры. Замените белую вилку с адаптером Luer и ввезу 3%hot agarose для заполнения адаптера.
Подключите шприц блокировки Luer к адаптеру Luer и ввезу 3%hot агарозу через черный резиновый бонг, чтобы заполнить шприц замка Luer. Разрешить от 10 до 20 минут для агарозы, чтобы остыть и затвердеть. Установите чип MOE, посеянный на прозрачном нагревателе ITO, который крепится на программируемой моторизованной ступени XY, которая поддерживается при 37 градусах цельсия.
Наполнить mNPCs вручную накачки в чип МЧС через средний выход, а затем инкубировать ячейки семенами ЧИП МЧС на обогреватель ITO в течение четырех часов. Используйте электрические провода для подключения мультиплексера EF к чипу MOE с помощью электродов на чипе. Подключите мультиплексер EF и генератор функций к усилителю для вывода импульсов квадратной волны DC.
Удалите все плоские нижние разъемы и адаптеры на чипе MOE и заполните адаптеры с ПОМОЩЬю PBS, затем запечатав отверстия адаптера парафильмом. После иммуностиммента наблюдайте за клетками с помощью конфокального флуоресцентных микроскопов. Стимуляция импульса DC привела к одновременному дифференциации мНПЦ на нейроны, астроциты и олигодендроциты в среде обслуживания стволовых клеток.
Процент нейронов, астроцитов и олигодендроцитов в контрольной группе и в группе стимуляции показаны здесь. После лечения пульса DC, mNPCs выразили значительно большое количество нейронов на DIV семь, астроциты на DIV три, и олигодендроциты на DIV семь и DIV 14 присутствовали на относительно более высоких уровнях в группах стимуляции, чем в контрольной группе. Нейросферы, образованные от 30 до 40 клеток, предпочтительнее для инициирования дифференциации mNPC.
Разрастание мНПЦ ухудшит выживаемость клеток в процессе дифференциации.
