Этот протокол демонстрирует, что можно внедрить исследовательский материал в трахею новорожденных крысиных щенков пятидневного возраста путем прямой визуализации. Этот метод повышает надежность введения исследуемого материала или препарата в трахею путем прямой визуализации. Избегая инъекций в трахею, этот метод уменьшает боль и, что более важно, кровотечение в трахею, что позволяет улучшить выживаемость.
Для выполнения этого протокола требуется развитие тонких навыков, включая соответствующее позиционирование животного, правильное использование операционного автоскопа для визуализации голосовых связок и эффективность введения в легкие. Продемонстрировать процедуру будут Тара Судхадеви, постдокторант из моей лаборатории, и Элисон Ха, аспирантка. Перед началом эксперимента подтвердите потерю хвостового и педального рефлекса у обезболенного пятидневного крысиного щенка и используйте лабораторную маркировочную ленту, чтобы удержать щенка в положении лежа на спине на плоской платформе, наклоненной под углом 45 градусов.
Используйте тупые щипцы, чтобы аккуратно потянуть язык в одну сторону, и с помощью зеркала отоскопа диаметром два миллиметра осторожно удерживайте язык на месте, чтобы гортань была видна. Используя операционный отоскоп с зеркалом правильного размера, найдите голосовые связки через увеличительную линзу отоскопа. Для интратрахеальной инстилляции загрузите одномиллилитровой шприц, оснащенный длинноугольным наконечником гелеобразной пипетки с 0,9 кубическими сантиметрами воздуха, а затем от 30 до 50 микролитров интересующего вещества.
Согните наконечник пипетки под углом 30 градусов и вставьте нагруженный наконечник пипетки через зеркало примерно на два миллиметра за пределы голосовых связок. Толкните поршень шприца, чтобы ввести интересующее вещество и воздух через зеркало в голосовые связки. Когда все вещество будет доставлено, поместите щенка на интегрированную грелку с циркулирующей жидкостью с температурой 38 градусов по Цельсию с мониторингом до регулярного дыхания, прежде чем воссоединить щенка с плотиной.
Чтобы оценить распределение вещества в образце легочной ткани, протрите грудную клетку и брюшную полость усыпленных детенышей крыс 70% этиловым спиртом и используйте стерильную технику для удаления легких в соответствии со стандартными протоколами для их визуальной оценки. В этом исследовании эффективность метода внутритрахеальной инстилляции оценивалась путем визуального осмотра легочной ткани, собранной у пятидневного крысиного щенка, завеленного синим красителем Эванса. Инстилляция была почти на 100% эффективной, так как краситель распространялся в легкие сразу после введения и распределялся по всем долям легочной ткани.
Краситель не наблюдался ни в каких тканях за пределами легких, что подтверждает способность техники использоваться для селективной доставки терапевтического средства, представляющего интерес для легких. Размещение животного первоначально под правильным углом над твердой поверхностью имеет важное значение для успеха следующего этапа визуализации голосовых связок с помощью работающего автоскопа.
