Этот новый эффективный метод изоляции субпопуляций сперматозоидов и сперматозоидов от взрослых мышей может быть использован для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе мейоза и сперматогенеза. Этот метод использует низкой цитотоксичности ДНК связывания красителя с широким спектром возбуждения, которые могут быть применены к наиболее используемых в настоящее время заказов FACS. Этот метод очень прост.
Наиболее сложным аспектом является цитометрия потока gating, но подробная стратегия gating должны помочь с адаптацией протокола к другим сортаторам клеток. Демонстрацией процедуры будет yu-Han Yeh, научный сотрудник лаборатории Сатоши Наметкавы. После сбора обоих яище от восьминедельного самца мыши, поместите ткани в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую два миллилитров ледяного PBS и удалите туника альбугинеа.
Аккуратно отделите яички типсами, чтобы слегка разогнать семенные трубочки. И перенесите трубоубий в каплю свежего ледяного PBS в 100-миллиметровую чашку Петри. Используйте типсы, чтобы аккуратно распутать трубоушки и мыть трубоушки в трех дополнительных капель PBS, как только что продемонстрировали.
После последней стирки поместите распутанные семенные трубочки в 15-миллилитровую трубку, содержащую два миллилитров буфера диссоциации для 20-минутной инкубации при 37 градусах цельсия. В конце инкубации используйте трубу из 1000 микролитров, чтобы аккуратно пипетку труб 20 раз, прежде чем вернуть трубку в инкубатор еще на шесть минут. В конце инкубации, пипетки ткани еще 20 раз, прежде чем вернуть трубку в инкубатор.
Через три минуты, осторожно пипетки трубы 10 раз или до тех пор, пока видимые части ткани остаются, прежде чем остановить диссоциацию с 10 миллилитров буфера FACS. Затем центрифуга к подвеске ткани два раза с помощью дополнительных 10 миллилитров для свежего буфера FACS для второй стирки, чтобы удалить сперматозоиды и как можно больше мусора, как это возможно. Чтобы испачкать клетки для цитометрического анализа потока, повторно приостанавливайте гранулы в три миллилитров буфера FACS.
И фильтровать подвеску клетки через 70 микрон нейлоновых клеток ситечко, в 50 миллилитров трубки. После подсчета, передача 10% клеток в новую трубку на льду, как незапачканный отрицательный контроль. И тщательно смешать шесть микролитров пятна DCV в оставшейся клеточной подвески.
После 30-минутной инкубации при 37 градусах По Цельсию в темноте с нежной тряской каждые 10 минут добавляйте в клетки пять микролитров DNase I. И фильтровать клетки через 35 микрон нейлоновой сетки ситечко в пять миллилитров FACS трубки на льду. Для цитометрического анализа потока клеток, создать новый эксперимент в программном обеспечении анализа потока, и в меню инструментов листа, нажмите новую плотность, чтобы создать передовую область рассеяния по сравнению с backscatter области плотности участка в линейном масштабе.
Нажмите на новую гистограмму, чтобы создать сюжет dcV синей гистограммы в логаритмическом масштабе. И нажмите кнопку начать и записать, чтобы начать обработку необлитаемого образца. В то время как образец работает, нажмите детектор и настройки порога, чтобы настроить как вперед, так и боковой рассеяния PMT напряжения для места необитых клеток в масштабе вперед и назад рассеяния участка.
Отрегулируйте напряжение PMT для канала jappy для того чтобы обнаружить местонахождение населенности DCV отрицательной в первой декаде участка logarithmic голубой гистограммы DCV. Затем нажмите стоп, чтобы выгрузить незапачканный образец. После краткого вихревого и загрузки окрашенных образца, нажмите следующую трубку, чтобы создать новый лист для образца.
Установите цитометр, чтобы приобрести по крайней мере один раз от 10 до шести событий, и нажмите кнопку начала и записи. Далее щелкните новую плотность, чтобы создать вперед высоту рассеяния по сравнению с вперед шириной рассеяния. И DCV синий против DCV красной плотности участков в линейном масштабе.
На передовую область рассеяния по сравнению с backscatter области плотности участка, использовать полигон инструмент, чтобы нарисовать ворота называется клетки, чтобы включить большую часть клеток и исключить мелкий мусор. Примените эти ворота к высоте вперед рассеяния по сравнению с вперед участок ширины рассеяния и использовать прямоугольник инструмент, чтобы нарисовать ворота одной ячейки, чтобы исключить не одной ячейки. Нанесите ворота одной ячейки на синий цвет DCV и участок красной плотности DCV и отрегулируйте шкалу для захвата расширенного профиля.
Используйте полигон инструмент, чтобы нарисовать ворота DCV, чтобы исключить незапачканные клетки и боковой популяции, и применить ворота к dcV синий участок гистограммы в линейном масштабе. Три основных пика относятся к различным содержанию ДНК 1C, 2C и 4C. Создайте второй синий DCV против dcV красный участок плотности в линейном масштабе.
И задние ворота DCV ворота на участок, чтобы найти 1C и 4C населения. Создайте другой dcV синий против DCV красный участок плотности в линейном масштабе. И используйте эллипс инструмент, чтобы нарисовать ворота на 1C населения.
Используйте полигон инструмент для ворот 4C населения с непрерывной кривой. И создать еще один DCV синий против DCV красной плотности участка в линейном масштабе. Используйте полигон инструмент для создания 4C один ворота.
В новом вперед бок о бок рассеяния участка, использовать эллипсовый инструмент для создания pachytene, диплотен и лептотен, zygotene сперматоцитов ворот. Когда все ворота были нарисованы, создать новый DCV синий против DCV красный цвет точка участок на линейной шкале, чтобы применить для 4C ворота, чтобы убедиться, что три популяции находятся в непрерывном порядке в воротах. Далее создайте новую область рассеяния вперед по сравнению с участком плотности backscatter области в линейном масштабе, и выберите единый размер клеток в качестве чистой круглой популяции сперматозоидов.
После сортировки, репрезентативные чистоты разделенных лептотена, zygotene, пахитена и диплотена сперматозоидов фракций, как правило, между 80%до 90%, как это подтверждается SYCP3 и Гамма H2AX иммуностимуляторов. Чистота круглого сперматозоидов фракция может быть подтверждена ядром окрашивания с DCV в сочетании с Sp56 и H1t окрашивания, а также, как правило, около 90% жизнеспособность изолированных популяций клеток, как правило, более 95%И средняя общая урожайность каждой фракции от одной взрослой мыши, как правило, достаточно для различных вниз по течению анализа. Отсортированные клетки могут быть использованы для различных следующего поколения секвенирования анализа, чтобы лучше изучить экспрессию генов и регуляции во время сперматогенеза.
