Этот протокол включает в себя новую химическую стратегию для применения терапевтических пептидов к металлическим поверхностям, и имеет потенциал для улучшения биосовместимости широкого спектра металлических биоматериалов. Это универсальный и надежный метод для приложения пептидов и терапевтических белков к голым металлическим поверхностям биоимплантов. Мы использовали эту технологию для улучшения биосовместимости металлических стентов путем приложения пептидов CD47, чтобы предотвратить воспалительные реакции, которые вызваны стентированием.
Начните с мытья фольги из нержавеющей стали купоны или сетчатые диски с 2-изопропанол в шейкере в течение пяти минут. Выполните эту стирку дважды, затем мыть образцы дважды с хлороформом в течение 10 минут за стирку. Поместите очищенные образцы нержавеющей стали в духовку при температуре 220 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
Погрузите запеченную фольгу или сетчатые диски в 0,5%aqueous раствор PABT и инкубировать их в шейкере в течение одного часа. Вымойте paBT-модифицированные образцы с деионизированной дистиллированной водой пять раз. Перенесите образцы на новый флакон и повторите стирку.
Лечить образцы с TCEP в течение 15 минут при комнатной температуре на шейкере. Дега деионизированных дистиллированной воды в круглой нижней колбе с вакуумным устройством генерации, таких как лиофилизатор, и мыть фольги или сетчатые диски с дегазационированной водой в пять раз. Перенесите образцы на новый флакон и повторите стирку.
Приготовьте пять миллилитров раствора 1%PEI-PDT, разбавляя 212,5 микролитров бульона PEI-PDT и 125 микролитров 0,4 ацетата натрия в дегазации воды. Инкубировать вымытые образцы нержавеющей стали с 1%PEI-PDT. Замените воздух аргоном, запечатайте флаконы герметичными и смешайте их на шейкере в течение одного часа.
Продолжить немедленно с пептидной спряжения или хранить образцы при четырех градусах по Цельсию в течение одной недели. Подготовка одного миллиграмма на миллилитр человеческого пептида CD47 фондовый раствор путем растворения человеческого пептида CD47 порошок в дегазации 50%acetic кислоты, а затем подготовить рабочий раствор путем растворения 500 микролитров запасов в 4,5 миллилитров дегазации PBS. Инкубировать промытые образцы PEI-PDT с рабочим раствором пептида CD47 при комнатной температуре при встряхивании в течение одного часа.
После завершения, мыть пептид CD47 покрытием образцов, как описано в тексте рукописи. Покрывая металлическую фольгу пептидом CD47 или скремблированным пептидом, вырежьте четверть дюйма ПВХ-трубки на три 38-сантиметровые кусочки и вставьте до восьми неизмененных, скремблированных пептидов или пептид CD47-модифицированных металлических фольг в три разные трубки. Соберите 30 миллилитров крови у здоровых доноров человека, свободных от каких-либо противооцитачных препаратов, предварительно загрузив шприц одним миллилитром 4% цитрата натрия, чтобы предотвратить коагуляцию собранной крови.
Положите 10 миллилитров крови в каждую трубку с помощью 10 миллилитров шприца и соедините концы металлическими адаптерами. Поместите заполненные кровью трубки на колеса петельного аппарата Чендлера и проймите кровь по металлической фольге путем вращения колес при 37 градусах по Цельсию в течение четырех часов. Слейте кровь из трубок и распоряжаться ею в соответствии с требованиями IRB, а затем сократить трубки скальпелем для получения фольги.
Приготовьте раствор 2%glutaraldehyde, разбавляя 70%-ный раствор в буфере какодилата натрия 0,1 моларного хлорида натрия. Инкубировать фольги в 2%glutaraldehyde раствор в течение 15 минут и хранить их при четырех градусах по Цельсию на ночь. Прежде чем анализировать металлические фольги, мыть их три раза с PBS.
Теплые восемь миллилитров PBS в водяной бане 37 градусов по Цельсию. Подготовьте 10 миллимолярный раствор для красителей CFDA, добавив 90 микролитров DMSO в один флакон CFDA, а затем подготовьте рабочее решение, добавив 75 микролитров запасов CFDA в теплый PBS. Переверните трубку несколько раз, чтобы смешать и покрыть его алюминиевой фольгой.
Поместите каждую фольгу в один миллилитр красителя CFDA в 24-хорошо пластины. Обложка пластины с алюминиевой фольгой и инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут, затем мыть фольги три раза в PBS и изображение их с флуоресценции микроскопа. Концентрация совместно связанного TAMRA конъюгированный пептид CD47 была количественно определена для определения максимальной плотности иммобилизации пептида на поверхности металла.
Максимальная задержка пептида составила около 180 нанограмм на сантиметр в квадрате, что было достигнуто при входной концентрации 100 микрограмм на миллилитр. Иммобилизация спряченного пептида CD47 TAMRA на модифицированных металлических поверхностях была дополнительно подтверждена флуоресцентной микроскопией, которая показала однородную флуоресценцию, испускаемую с поверхности спряженных пептидных сетчатых дисков TAMRA CD47. Только минимальная флуоресценция была обнаружена на поверхности контрольных сеток, которые не имели модификации, тем самым исключая не специально связанный TAMRA спряженный пептид CD47 в качестве основного источника флуоресценции.
Было также подтверждено, что пептид CD47 покрытием поверхностей показывают резкое сокращение кроветворных клеток вложения по сравнению с вскарабкался модифицированных и неизмененных пептид управления. Моноциты, изолированные от клеток крысиного буйного пальто, были обуработались на голом металле и пептиде CD47-модифицированных фольгах из нержавеющей стали. На функциональных поверхностях наблюдалось 58%-ное увеличение острой моноцитной привязанности, их преобразование в макрофаги и пролиферация макрофагов.
При попытке этого протокола, очень важно выполнить шаги, связанные с дегазатированной воды или реагентов, которые должны быть выполнены как можно быстрее и свести к минимуму воздействие кислорода. Наша технология избирательно модулирует клеточное взаимодействие с металлическими поверхностями и типичный анализ идентификации типа клеток, такие как RT-PCR, цитометрия потока и иммунофлуоресценция, совместимы с этой техникой. При создании целого ряда биологически активных пептидов, эта технология может быть полезным в повышении биосовместимости в интерфейсе материала ткани.
