Этот протокол позволяет измерить способность антител к опсонизации и вызвать фагоцитоз плазмодия falciparum инфицированных эритроцитов. Антитела, присутствующие в сыворотке крови лиц, естественно подверженных паразитарной инфекции, а также те, которые вызваны иммунизацией с паразитами антигенов, могут быть проверены. Демонстрацией процедуры со мной будет Майкен Висти, техник из моей лаборатории.
Чтобы создать культуру клеток THP-1 для анализа фагоцитоза, за день до эксперимента семени клеток в 25-сантиметровом квадрате культуры колбу и концентрации 2,5 раза 10 до пятой клетки на миллилитр в THP одной клеточной культуры среды. В день эксперимента, по крайней мере за час до начала эксперимента блок круглым дном 96-хорошо пластин с 150 микролитров стерильных 2%FBS в PBS на колодец. Для середины-поздней стадии трофозоита инфицированных эритроцитов сбора и очистки, подготовить около 1,2 миллилитров упакованы P falciparum паразита культуры в 10 миллилитров паразита культуры среды, по крайней мере 5%parasitemia и добавить к магнитной колонке.
Вымойте колонку 50 миллилитров среды культуры паразитов. Чтобы избавить инфицированных эритроцитов, удалить столбец из магнита и промыть его с 50 миллилитров паразита культуры среды. Затем, собирать инфицированных эритроцитов центрифугации и повторно гранулы в один миллилитр свежих паразитов культуры среды для подсчета.
Отрегулируйте очищенную инфекционную эритроцитную суспензию в 3,3 раза 10 до седьмого клетки на миллилитр в среде культуры паразитов, содержащей бромид этидия, до конечной концентрации 2,5 микрограмма на миллилитр. Затем удалите блокирующий раствор с одной пластины из 96 колодец, смахивая тарелку в контейнер для отходов. Затем удалите излишки на бумажное полотенце и добавить 30 микролитров этидия бромид этикетки инфицированных эритроцитов подвески для всех, кроме одного хорошо в верхней половине пластины.
Добавьте 30 микролитров среды культуры паразитов в пустой колодец и инкубировать пластину в течение 10 минут при комнатной температуре, защищенной от света. В конце инкубации добавьте 170 микролитров среды культуры паразитов к каждой хорошо и осадок инфицированных эритроцитов в нижней части пластины центрифугации. Удалите супернатант, щелкивая пластину в контейнер для отходов, и мыть этидий бромид помечены инфицированных эритроцитов еще два раза, с 200 микролитров паразита культуры среды на колодец, как только что продемонстрировали.
После второй стирки используйте многоканарную пипетку, чтобы тщательно удалить весь объем супернатанта из каждой системы, не нарушая гранулы. И повторное использование этидия бромид помечены инфицированных эритроцитов в 30 микролитров раствора антител, в том числе соответствующие элементы управления и тестовые образцы, ранее подготовленные в среде культуры паразитов. Затем поместите пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 45 минут, защищенных от света.
В то время как инфицированные эритроциты в настоящее время opsonized, собирать THP-1 клетки центрифугации, и повторно гранулы в 12 миллилитров свежих, предварительно нагревается THP-1 клеточной культуры среды. После второй центрифугации, повторно гранулы в один миллилитр THP-1 клеточной культуры среды для подсчета, и настроить концентрацию клеток в пять раз от 10 до пятых клеток на миллилитр в THP-1 клеточной культуры среды. Удалите блокирующий раствор со второй пластины 96-колодец и добавьте 100 микролитров клеток THP-1 к каждой хорошо.
Затем поместите пластину в инкубатор клеточной культуры. В конце инкубации опсонизации добавьте 170 микролитров среды культуры паразитов к каждому колодец оссонизации пластины, и осадок инфицированных эритроцитов на дно пластины центрифугации. Вымойте опсонизированные инфицированные эритроциты два раза с 200 микролитров паразита культуры среды на колодец, используя многоканарный пипетку, чтобы тщательно удалить супернатант после второй стирки.
Resuspend opsonized зараженных эритроцитов в 100 микролитров предварительно разогретой THP-1 клеточной культуры среды на колодец, и передачи 50 микролитров каждого опсонизированных инфицированных эритроцитов подвески в соответствующий колодец в фагоцитоз пластины. Когда все клетки были добавлены, поместите пластину в инкубатор культуры клеток в течение не более 40 минут, защищенных от света. В конце инкубации, остановить фагоцитоз центрифугации при четырех градусах по Цельсию.
Удалить супернатант и повторно гранулы с 150 микролитров комнатно-температурного раствора хлорида аммония на колодец. Ровно через три минуты добавьте 100 микролитров ледяного холода при 2%FBS в PBS, чтобы остановить лиз, и от осадка нетронутых клеток центрифугации. Далее, мыть клетки три раза с 200 микролитров свежего ледяного 2%FBS в PBS на колодец, за стирку.
После окончательной стирки, повторное распределение гранулы клетки в 200 микролитров свежего ледяного холода 2%FBS в PBS на колодец. Для приобретения и анализа цитометрии потока немедленно загрузите клетки на цитометр потока и используйте линейный вперед по сравнению с линейным боковым рассеянием участка для скважин без зараженных эритроцитов к воротам клеток THP-1. Приобретите 10 000 событий в этих воротах, и используйте клетки THP-1 с инфицированными эритроцитами, опсонизированными с положительным контролем, чтобы создать сюжет гистограммы для измерения интенсивности флуоресценции бромистого этидия.
Для анализа откройте линейный вперед и линейный участок рассеяния стороны для колодцев без зараженных эритроцитов и ворота клеток THP-1. Затем установите положительные ворота в гистограмме FL-3 и скопируйте эти ворота на все другие пробные скважины, чтобы определить процент клеток этидия бромисто-положительного THP-1. Для каждого образца испытания, фагоцитоз может быть сообщено как абсолютное значение или как относительный фагоцитоз рассчитывается в процентах с использованием положительного контроля, как максимум.
Клетки THP-1 должны периодически проверяться на экспрессию поверхности гамма-рецепторов с помощью цитометрии потока. Клетки должны быть отрицательными для CD16 и положительными для CD32 и CD64. В этом эксперименте опсонизации, THP-1 клетки были закрыты в первую очередь в соответствии с их вперед и стороны рассеяния профилей, чтобы квантификация процент этидия бромисто-маркированных клеток, что свидетельствует о клетках, которые фагоцитов по крайней мере одно антитело опсонизированных инфицированных эритроцитов.
Отрицательные образцы контроля должны генерировать один отрицательный пик в канале FL3, с несколькими событиями, наблюдаемыми в маркере бромистого этидия. Соответственно, средние значения фагоцитоза, как абсолютные клетки бромистого этидия, положительные THP-1, так и относительные проценты фагоцитоза, должны быть очень низкими. В отличие от этого, положительный контроль должен генерировать следы с двумя пиками, отрицательным пиком и явно положительным и хорошо разделенным пиком, расположенным в пределах бромистого маркера этидия.
Средние значения фагоцитоза, как правило, являются самыми высокими для позитивного контроля, за которыми следуют женский бассейн, подвергшийся воздействию малярии, и единый женский контроль, подвергшийся воздействию малярии. Хотя эта методология приносит последовательные результаты, наблюдаются отклонения в коэффициенте наклона скорректированных линий. Поэтому рекомендуется использовать относительные значения, особенно если невозможно запустить все образцы в одном эксперименте.
Обязательно спланируйте эксперимент заранее, подготовив как клетки THP-1, так и паразитов соответственно, используя только трофициты с чистотой более 80%Кроме того, обязательно обязательно включите соответствующие элементы управления, чтобы качество эксперимента оценивалось и облегчали анализ данных.
