smFISH известен для измерения абсолютного числа как суб-клеточного расположения мРНК. Наш двухцветный протокол sMFISH имеет дополнительную возможность измерения кинетики транскрипции и деградации мРНК. Используя этот метод, многие образцы могут быть обработаны одновременно без дополнительного времени или усилий.
Например, за восемь часов для визуализации можно обработать четыре эксперимента по обработке времени, в результате 48 образцов. Наш протокол широко применим для многих генов и бактериальных видов. Для подготовки крышки скользит и стеклянные слайды для эксперимента.
Используйте типсы, чтобы поместить крышку скользит и слайды в банку Coplin, содержащий 100% этанола и место банку в ультразвуковой ванне для воды удовлетворить в течение 15 до 20 минут. В конце sonication мыть слайды и крышка скользит три-четыре раза с ультра чистой водой, прежде чем пополнить банку с 70%этанола и повторяя sonication. Когда все звуковые шаги будут сделаны, высушите крышку скользит и скользит с азотным газом.
Поместите крышку скользит в пустой 1000 микролитер пипетка кончик коробки и поместите слайды в чистую коробку слайда. Затем, следуя отверстиям пипетки кончик коробки использовать гидрофобный маркер, чтобы нарисовать круги на крышку скользит и применить 20 микролитера падение 0,1%Поли l лизин для каждой из этих скважин. Чтобы настроить эксперимент по курсу времени, добавьте 750 микролитров из 20 миллилитров экспоненциально растущей культуры E.coli в 1,5 миллилитровую культурную трубку, отмеченную нулевым временем.
И немедленно инвертировать трубку. Индуцировать выражение лака с 0,2 до одного миллимоляра IPTG и начать таймер. Проверив таймер, соберите культуру клеток в каждой последовательной экспериментальной точке времени, как только что продемонстрировано.
В соответствующий момент времени в ходе эксперимента добавьте пять миллимолярной ONPF в колбу, чтобы подавить выражение лака и продолжайте образец культур для отслеживания деградации мРНК. В конце времени, когда образец курса приобретения, инкубировать образцы при комнатной температуре в течение 15 минут с последующим инкубации на льду в течение 30 минут. В конце инкубационой центрифуги образцы для удаления фиксатора и использования пипетки для удаления супернатанта.
Повторно приостанавливать бактерии в один миллилитр DEPC PBS и мыть клетки еще два раза в один миллилитр свежего DEPC PBS за стирку. После последней стирки повторно приостанавливаем клетки в 30 микролитров свежего DEPC PBS. Для проницаемой клетки.
Сначала добавьте образец из каждой точки времени в отдельные гидрофобные скважины на одном из этанола стерилизованных стеклянных покрытий скользит. И позволить клеткам придерживаться крышки скольжения с 10 до 30 минут инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации добавьте 15 микролитров по 70% этанола к каждой колодец.
Через четыре минуты, аспирировать этанол из каждой скважины, так что скважины полностью сухой. После мытья добавьте 30 микролитров раствора предварительной гибридизации к каждой колодец проницаемых клеток, и инкубировать клетки в течение 30 минут в духовке 37 градусов по Цельсию. Замените предварительное решение гибридизации примерно на 30 микролитров раствора гибридизации зонда на колодец.
И накройте камеру алюминиевой фольгой в течение двух часов инкубации в духовке 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации используйте многоканарную пипетку для полоскания скважин три-пять раз с помощью 30 микролитров раствора для мытья на скважину на стирку. После последней стирки, инкубировать клетки в течение 15 до 30 минут при 37 градусах по Цельсию перед мытьем скважин пять раз с 30 микролитров свежих DEPC PBS за стирку.
После последней стирки, аспирировать всю жидкость из крышки скольжения. И добавить четыре микролитров свежего DEPC PBS к каждой хорошо. Используйте типсы, чтобы тщательно поместить крышку скольжения на этанол стерилизованный образец слайда сторону вниз, и использовать силиконовую зубную резинку, чтобы запечатать края крышки скольжения.
Чтобы найти область интереса, выберите живой режим фазовой контрастной визуализации и маневрируете джойстиком сцены, чтобы изменить поле зрения внутри колодец. Расположена область, в которой плотность ячейки является оптимальной, и отрегулируйте фокус так, чтобы фазово-контрастные изображения клеток были в фокусе. Затем приобрети изображение C 5 с четырех секундной экспозицией, изображение C 3 с двух секундной экспозицией и фазовое контрастное изображение с 0,2-секундной экспозицией примерно для 10 различных областей на колодец.
Кроме того, можно запустить приобретение NDI, в котором C пять, C 3 и фазовая контрастность изображений приобретаются в серии. Когда все скважины будут изображены, откройте соответствующий инструмент сегментации ячеек и неликовой стек. Загрузите изображения контраста фазы, представляющие интерес, и выберите независимые кадры и нажмите на профиль фазы вычисления как ноль.
Начать процесс сегментации, в ходе которого будут идентифицированы ячейки и рассчитаны их контуры. Загрузите параметры, предусмотренные в папке GitHub, и нажмите на все кадры. В конце обработки выберите контур для визуализации сетки.
Далее, под вкладкой обнаружения пятна, неконтролируемый стек, проверить сетки и нажмите руб, чтобы начать идентификацию пятна и количественной оценки на основе двух D Gaussian установки. Выберите папку, содержащую флуоресцентные изображения, и файл сетки, который только что был рассчитан из процедуры обнаружения ячейки, и укажите имя файла, на которое будут сохранены результаты обнаружения пятна. Затем используйте рабочий процесс анализа изображений, представленный на GitHub, для анализа изображений флуоресценции.
В этом полном поле зрения можно наблюдать около 500 клеток E.coli при хорошей плотности для сегментации клеток. Морфология клеток в фазовых контрастных изображениях должна оставаться сопоставимой с изображениями живых клеток для целей сегментации. Если клетки более проницаемы, их морфология станет непригодной для сегментации.
Распределение интенсивности пятна лака и мРНК перед индукцией не очень хорошо вписывается в нормальное или пуассон-распределение из-за наличия пятен с высокой интенсивностью. Когда экспрессия лака индуцируется, сигнал пяти простого лака и мРНК увеличивается до того, как увеличивается три основных сигнала лака и мРНК. Если выражение лака и подавляется как пять, так и три основных сигнала лака и мРНК уменьшаются.
Чтобы получить скорость транскрипции удлинение, рост пять и три основных сигналов подходят с линиями. В то время как скорость деградации мРНК получена путем установки области распада с экспоненциальной функцией. Поскольку одноя молекула рыбы является одноклеточной техникой, изменчивость клеток и клеток в транскрипции также может быть проанализирована.
Кроме того, анализ колокализации пяти премьер и три премьер лака мРНК позволяет количественно плотности РНК-полимеразы на гене лака. Поскольку образцы из разных точек времени обрабатываются одновременно во время этой процедуры. Важно держать образец разделенным пока они в пробках и на скольжении крышки.
Использование этой одной молекулы одноклеточной микроскопии техники. Теперь исследователи могут исследовать, как транскрипция и кинетики деградации мРНК связаны с абсолютными числами или субклеточными местоположениями мРНК.
